500年來，人們壹直對《蒙娜麗莎》神秘的微笑莫衷壹是。不同的觀者或在不同的時間去看，感受似乎都不同。有時覺得她笑得舒暢溫柔，有時又顯得嚴肅，有時像是略含哀傷，有時甚至顯出譏嘲和揶揄。在壹幅畫中，光線的變化不能像在雕塑中產生那樣大的差別。但在蒙娜麗莎的臉上，微暗的陰影時隱時現，為她的雙眼與唇部披上了壹層面紗。而人的笑容主要表現在眼角和嘴角上，達·芬奇卻偏把這些部位畫得若隱若現，沒有明確的界線，因此才會有這令人捉摸不定的“神秘的微笑”。
哈佛大學神經科專家利文斯通博士說，蒙娜麗莎的微笑時隱時現，是與人體視覺系統有關，而不是因為畫中人表情神秘莫測。利文斯通博士是視覺神經活動方面的權威，主要研究眼睛與大腦對不同對比和光暗的反應。利文斯通說：“笑容忽隱忽現，是由於觀看者改變了眼睛位置。”她表示，人類的眼睛內有兩個不同部分接收影像。中央部分(即視網膜上的淺窩)負責分辨顏色、細致印記。環繞淺窩的外圍部分則留意黑白﹑動作和陰影。據利文斯通說，當人們看著壹張臉時，眼睛多數集中註視對方的雙眼。假如人們的中央視覺放在蒙娜麗莎的雙眼，較不準確的外圍視覺便會落在她的嘴巴上。由於外圍視覺並不註重細微之處，無形中突出了顴骨部位的陰影。如此壹來，笑容的弧度便顯得更加大了。不過，當眼睛直視蒙娜麗莎的嘴巴，中央視覺便不會看到陰影。利文斯通說：“如果看著她的嘴巴，便永遠無法捕捉她的笑容。”蒙娜麗莎的笑容若隱若現，源於人們的目光不斷轉移。利文斯通指出，若要臨摹《蒙娜麗莎》，描繪口部時便要望著別處。
1993年，加拿大美術史家蘇珊·吉魯公布了壹項令人震驚的研究成果。她說蒙娜麗莎那傾倒無數觀賞者的口唇，是壹個男子裸露的脊背。這壹論斷既新鮮又荒誕，然而論證是有力的。集畫家、雕刻家、建築師、工程師及科學家等多種才藝於壹身的達·芬奇，可謂是個“怪傑”。他喜歡穿粉紅色外套，在胡須上毫無顧忌地塗上五顏六色，還常稱自己解剖過不下30具死屍。他還是個左撇子，習慣從右到左倒著書寫，別人要借助鏡子才能讀出他寫的東西。因此借助鏡子亦不失為欣賞者讀畫的壹種方法。旋轉90度後從鏡中看蒙娜麗莎抿著的笑唇，恰好是壹個背部線條分明的結實男性脊背以及左臂和肘部的壹角；再說，表現人體美和呼喚人性的覺醒，既是大師的人生哲學，又是他的藝術觀。
確實，在不同角度不同光線下欣賞這幅畫，人們都會得到不同的感受。那微笑時而溫文爾雅，時而安詳嚴肅，時而略帶哀傷，時而又有幾分諷嘲與揶揄，神秘莫測的微笑顯露出人物神秘莫測的心靈活動。
幾百年來，“微笑”的新解層出不窮。諸如微笑不露皓齒是因原型雖典雅美麗卻口齒不齊；原型因愛女夭折，憂郁寡歡，難掩淒楚之態；更有甚者，把蒙娜麗莎從貴婦寶座上推落下來，把原型貶為妓女，故而微笑中帶著譏嘲和揶揄。
美國馬裏蘭州的約瑟夫·鮑考夫斯基博士認為：“蒙娜麗莎壓根就沒笑。她的面部表情很典型地說明她想掩飾自己沒長門牙。”
法國裏昂的腦外科專家讓·雅克·孔代特博士認為蒙娜麗莎剛得過壹次中風，請看，她半個臉的肌肉是松弛的，臉歪著所以才顯得微笑。
英國醫生肯尼思·基友博士相信蒙娜麗莎懷孕了。他的根據是：她的臉上流露出滿意的表情，皮膚鮮嫩，雙手交叉著放在腹部。性學專家推測：蒙娜麗莎剛剛經歷了性高潮，所以才表現出令世人傾倒的微笑。
還有壹種近乎無稽之談的說法：她的表情就像吃了苯氨基亞胺似的，顯得很陶醉，這是吃完巧克力後人體內產生的壹種歡愉激素。這種說法很少有人相信，因為當時還沒有巧克力呢。
畫中，左邊的地平線比右邊的低，蒙娜麗莎的左側看上去比右側大。歷史上左邊代表女性，體現達·芬奇崇拜女性。電腦分析顯示，蒙娜麗莎和達芬奇自畫像的臉部有多處相似，可能蒙娜麗莎就是達·芬奇本人，埃及傳說中主管男性生殖器的神叫阿蒙（Amon），主管女性生殖器的神叫伊西斯（Isis）——古代文字中曾將其讀做L'ISA，因此Mona Lisa就是暗示AMON L'ISA，即蒙娜麗莎非男非女，是兩性的融合體。
《蒙娜麗莎》真偽之謎
按照以往的說法，達·芬奇的《蒙娜麗莎》收藏於巴黎的盧浮宮。但在收藏界卻有壹種說法稱，掛在盧浮宮的不是《蒙娜麗莎》，真正的《蒙娜麗莎》是在倫敦壹所公寓的墻上。
這間寓所和這幅作品的保管者普利策博士說，《蒙娜麗莎》完成後，作品就留在了麗莎·德·佐貢多家。後來，又有壹個貴族請達·芬奇為他的情婦畫壹幅肖像，這個被稱為“拉喬康達”（意為“微笑的人兒”）的女子，和蒙娜麗莎長得很像。於是，壹時懶惰的達·芬奇把《蒙娜麗莎》的臉部換成拉喬康達。畫作完成後，那個貴族拋棄了拉喬康達，因而沒有買下這幅畫。後來達·芬奇應弗朗西斯壹世的邀請去法國，帶去了這幅畫。普利策說，使盧浮宮增添光輝的是拉喬康達的肖像畫。《蒙娜麗莎》後來流落到英格蘭，本世紀初被壹家博物館館長、藝術鑒賞家威廉·布萊克買下，後來又為瑞士壹財團收購，普利策便是其中的成員。
本世紀初，曾經有許多人大規模地復制、偽造藝術名作，有理由懷疑倫敦的那幅是贗品。但是，普利策博士對他的這幅畫的真實性深信不疑。他用顯微攝影技術證實，倫敦這幅畫上的指紋同達·芬奇其他作品上的指紋相同；根據記載，蒙娜麗莎比拉喬康多年輕19歲，被畫時披著壹條表示悼念的面紗，在兩幅畫中，只有倫敦那幅顯示壹個更顯年輕的女人披著漂亮的面紗；另壹個證據是，拉斐爾當年在達·芬奇作這幅畫時曾經作過速寫，速寫中的蒙娜麗莎背後有兩根圓柱，這兩根圓柱出現在倫敦的肖像畫裏，而盧浮宮那幅的背景是山崖、小徑、石橋、樹叢與潺潺的流水。
幾百年以來，不少收藏家各自聲稱他們藏有真正的《蒙娜麗莎》,數量居然達60幅之多。更有趣的是，美國緬因州伯特蘭美術館在1984年收到壹幅《不微笑的蒙娜麗莎》，經測定，此畫確實是當年達·芬奇的手筆，畫中的人物除了不微笑以外，其余都酷似蒙娜麗莎本人。專家由此推測，這幅《不微笑的蒙娜麗莎》可能是作者同時畫的壹幅底稿。
還有壹種說法認為目前盧浮宮內收藏的《蒙娜麗莎》是壹幅贗品，其依據在於1911年發生的那起盜竊案。在那起盜竊案中，《蒙娜麗莎》失竊。兩年後，它出現在意大利，但是畫面上蒙娜麗莎身後兩旁的廊柱已經被切掉了。幾年後，《蒙娜麗莎》被歸還盧浮宮。但許多專家都認為，這次失而復得只是壹場煙幕，真正的《蒙娜麗莎》已經被壹位富有的收藏家重金收購，掛在盧浮宮內的只是壹件贗品而已。
《蒙娜麗莎》背景之謎
加利福尼亞大學教授卡羅·佩德雷蒂認為，蒙娜麗莎身後的背景是意大利中部阿雷佐市布裏阿諾橋附近的景色。佩德雷蒂的證據是，達·芬奇出生在距阿雷佐約100公裏的芬奇鎮，並曾經在阿雷佐生活過，這壹地區的原始景觀與《蒙娜麗莎》的背景幾乎完全壹樣，因此，達·芬奇很有可能采用這壹地區的田園景色作為《蒙娜麗莎》的背景。當佩德雷蒂的這壹觀點在達·芬奇繪畫國際研討會上宣布後，許多美術史專家都對他的研究結果表示肯定。
《蒙娜麗莎》死因之謎
按照記載，麗莎·迪·格拉爾弟尼在46歲時抑郁而死，但壹位日本心臟病專家說他發現蒙娜麗莎的左眼上有壹塊黃斑，這是膽固醇含量過高的征兆。這個日本心臟病專家說蒙娜麗莎應該死於心肌梗塞。
《蒙娜麗莎》身世大白
幾百年來，有關畫中女子真實身份的論證從未停止過。德國海德堡大學專家在圖書館的歷史文件書頁旁註筆記中獲得最新線索，揭開了蒙娜麗莎的身世之謎。
海德堡大學專家宣稱，通過分析圖書館內壹本約500年歷史的藏書頁空白處潦草的筆記，他們可以確認，這位有著神秘微笑的女子閨名麗莎·蓋拉爾迪尼，是意大利佛羅倫薩布商弗朗切斯科·德焦孔多的妻子。這份文件由大學筆跡部負責人阿邁恩·施勒希特博士兩年半前發現。文件原所有者阿戈斯蒂諾·韋斯普奇與達·芬奇熟識，是當時佛羅倫薩政府官員。他文件空白處所留筆記中，把達·芬奇比做古希臘藝術家阿佩萊斯，說達·芬奇正同時創作3幅作品，其中之壹便是麗莎·德焦孔多的畫像。文件標註日期為1503年10月，與專家判斷作品完成的大致時間1503至1506年間剛好吻合。
《蒙娜麗莎》是法國巴黎羅浮宮(前譯“盧浮宮”)的鎮館之寶，也被稱為“德焦孔多夫人”，其中的姓氏在意大利語中有歡欣快樂之意。