細胞內蛋白質的提取；
用1、Trixon-100或NP-40裂解物裂解；
2、凍融開裂法；
3.研磨方法；
“經典的就是分子克隆2說的，用RIPA破解，刮去，冷凍30分鐘，超級生長，4度離心10分鐘。”
(1)單層貼壁細胞總蛋白的提取:
1.倒出培養液，將瓶子倒扣在吸水紙上，使吸水紙吸起培養液(或把瓶子直立壹會兒，使殘留的培養液流到瓶底，再用移液管吸走)。
2.向每瓶細胞中加入3ml 4℃預冷的PBS (0.01m pH 7.2 ~ 7.3)。輕輕搖勻細胞1分鐘，清洗細胞，然後丟棄洗液。重復上述操作兩次，* * *洗細胞三次，洗掉培養基。丟棄PBS並將培養瓶置於冰上。
3.根據1ml，向裂解物中加入10 μl PMSF(100mM)，搖勻，置於冰上。(PMSF只能在搖動至無結晶時與裂解液混合。)
4.向每瓶細胞中加入400 μ含PMSF的裂解液，在冰上裂解30分鐘。為了充分溶解細胞，經常來回搖動培養瓶。
5.裂解結束後，用幹凈的刮刀(快速移動)刮去培養瓶壹側的細胞，然後用槍將細胞碎片和裂解液移入1.5ml離心管中。(整個操作盡量在冰上進行。)
6.在4℃下以12000轉/分鐘離心5min。(提前啟動離心機預冷)
7.將離心後的上清液轉移到離心管中0.5分鐘，並儲存在-20℃下。
(2)從組織中提取總蛋白:
1，將少量組織塊放入1 ~ 2ml勻漿器的球形部分，用幹凈的剪刀將組織塊盡量剪下。
2.向勻漿器中加入400 μl單壹洗滌劑裂解物(包括PMSF)進行勻漿。然後把它放在冰上。
3.幾分鐘後，磨壹會兒，然後放在冰上。重復研磨幾次，盡可能地壓碎組織。
4.裂解30 min後，用移液管將裂解液轉移至1.5ml離心管中，然後在4℃下以12000rpm離心5min，將上清液分裝於0.5ml離心管中，並儲存於-20℃。
(3)從用藥物處理的貼壁細胞中提取總蛋白質:
由於藥物的影響，壹些細胞脫落，所以除了根據(1)的操作之外，還應該收集培養液中的細胞。以下是從培養基中提取細胞總蛋白:
1.將培養液倒入15ml離心管中，以2500rpm離心5分鐘。
2.棄去上清液，加入4ml PBS，用槍輕輕吹洗，然後以2500rpm離心5分鐘。棄去上清液後，再次用PBS洗滌。
3.用槍洗滌上清液後，加入100 μl裂解液(含PMSF)進行冰裂解30min，裂解過程中頻繁彈彈，使細胞充分裂解。
4.將裂解物與培養瓶中的裂解物混合，在4℃和12000rpm離心5min，然後取上清液置於0.5ml離心管中，保存於-20℃。
(2)蛋白質含量的測定
(1)制作標準曲線
1.從-20℃取出1mg/ml BSA，室溫融化備用。
2.取1.5ml的18離心管，分別標註為0μg、2.5μg、5.0μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg。
3.根據下表在每個試管中添加各種試劑。
0微克2.5微克5.0微克10.0微克20.0微克40.0微克
1毫克/毫升牛血清白蛋白- 2.5微升5.0微升10.0微升20.0微升40.0微升
0.15摩爾/升氯化鈉100微升97.5微升95.0微升90.0微升80.0微升60.0微升
4、混合後，室溫放置2分鐘。生物分光光度計(Eppentoff)上的比色分析。
(2)檢測樣品的蛋白質含量
1，取足夠的1.5ml離心管，每管加入1ml 4℃保存的考馬斯亮藍溶液。室溫靜置30分鐘後，可用於蛋白質測定。
取壹管考馬斯亮藍，加入0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混勻，靜置2分鐘，作為空白樣品。將空白倒入比色杯中，並根據標準曲線程序測量空白樣品。
3.丟棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色皿兩次(每次0.5ml)，然後再次用無菌水清洗。
取壹管考馬斯亮藍，加入95μl 95μL 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μL待測蛋白樣品，混勻後靜置2min，倒入帶扣比色杯中，按下樣品鍵，測試樣品。
註意:對於每個樣品，比色皿應該用無水乙醇清洗兩次，用無菌水清洗壹次。多個樣品可以同時混合，然後壹起測量，可以節省大量蛋白質樣品測量的大量時間。測量結果為5 μl樣品的蛋白質含量。
(3) SDS-PAGE電泳
(1)清潔玻璃板:
壹只手扣緊玻璃板，另壹只手蘸洗衣粉輕輕擦洗。用自來水沖洗兩面，然後用蒸餾水沖洗幹凈，放在籃子裏晾幹。
(2)灌膠和裝樣
1.玻璃板對齊後，放入夾具中夾緊。然後垂直貼在架子上準備倒膠。(操作時，將兩塊玻璃對齊，以免漏膠。)
2、用隔離膠，加入TEMED後，立即搖勻倒膠。倒膠時，可用10ml槍吸5ml膠，沿玻璃釋放，直至膠面上升至綠化帶中線高度。然後在膠裏加壹層水，液封後凝膠會更快。(倒膠時可以開始快壹點，膠面達到要求的高度時慢壹點。操作時膠水壹定要順著玻璃板往下流，這樣膠水裏就不會有氣泡了。慢慢加水封口，不然膠水會變形。)" S9 O. L+ `- T: E
3.當水和膠水之間有折射線時，膠水已經凝固。等3分鐘膠水完全凝固後，就可以把膠水上層的水倒掉，用吸水紙吸幹。
4、用5%的濃縮膠，加入TEMED，立即搖動即可倒膠。用濃縮膠填滿剩余的空間，然後將梳子插入濃縮膠中。倒膠時，膠也要順著玻璃板往下流，避免膠內出現氣泡。插入時保持梳子水平。因為膠凝固時體積會收縮減小，加樣孔的裝樣體積會減小，所以在濃膠凝固過程中需要經常補充兩側的膠。當濃縮膠凝固後，雙手握住梳子兩側，輕輕垂直向上拔出。
5.用水沖洗濃縮凝膠，放入電泳槽中。(小玻璃板朝內，大玻璃板朝外。如果只有壹片塑料運行，凹槽的另壹側應墊上塑料板，字側朝外。)
測得蛋白質含量後，計算含50μg蛋白質的溶液體積，即為上樣量。取出上樣樣品於0.5ml離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至最終濃度為1×。(壹般上樣總體積不超過20μl，上樣孔最大可達25μl..)在裝載前，將樣品在沸水中煮沸5分鐘，以使蛋白質變性。
7.加入足夠的電泳液後，開始準備樣品。(電泳液至少應溢出內部測試的小玻璃板。)用微量取樣器將樣品吸在墻上，吸出樣品時不要吸入氣泡。將取樣器的針頭插入取樣孔，並慢慢加入樣品。(如果加樣太快，樣品會被沖出孔外，如果有氣泡，樣品可能會溢出。添加下壹個樣本時，取樣器應在外槽的電泳緩沖液中清洗3次，以避免交叉汙染。
(3)電泳電泳時間壹般為1-2 h，電壓為80，或100。可以停止電泳，直到溴酚藍剛好用完，可以進行膜轉移。
(4)轉移膜
(1)轉移壹張膜需要6張7.0 ~ 8.3 cm的濾紙和1張7.3 ~ 8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜的時候壹定要戴手套，因為手上的蛋白質會汙染膜。切割好的硝酸纖維素膜必須在水中浸泡2小時後才能使用。(用鑷子夾住膜的壹邊，輕輕放入裝有超純水的平皿中。要使膜浮在水面上，只有下層與水接觸。使得整個膜可以由於毛細作用而被潤濕。如果薄膜沈入水中，薄膜與水之間會形成壹層空氣膜，阻止薄膜吸水。
(2)將轉印膜夾、兩塊海綿墊、壹根玻璃棒、濾紙和浸濕的膜放入盛有轉印膜液的搪瓷盤中。
(3)打開夾子，保持黑邊水平。放壹個海綿墊在上面，用玻璃棒來回滾動幾次，把裏面的氣泡滾走。壹只手壓住墊子，另壹只手壓住墊子，讓它不能隨便動。在墊子上放三層濾紙(可以先在墊子上疊三張紙)，壹只手固定濾紙，另壹只手用玻璃棒滾出氣泡。
(4)剝膠前應先將玻璃板撬開。撬的時候動作要輕，兩邊要輕輕反復撬。過了壹會兒，玻璃板開始松動，直到被撬開。撬的時候要小心，玻璃板容易裂。)取下小玻璃板後，輕輕刮掉濃縮膠(濃縮膠影響操作)，避免刮傷隔離膠。小心剝掉濾紙上的離型膠皮，用手調整使其與濾紙對齊，用玻璃棒輕輕將氣泡滾出。把膜蓋在膠上，把整個膠蓋好(蓋了膜就不能動了)，去掉氣泡。用3張濾紙覆蓋薄膜，去除氣泡。最後蓋上另壹個海綿墊，滾動幾下合上夾子。整個操作都是在轉移液中進行的，要不斷地去除氣泡。膜兩側的濾紙不能相互接觸，接觸後會發生短路。(轉移液中含有甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門讓空氣流通。)
將夾子放入傳輸槽，使夾子的黑色面朝插槽的黑色面，白色面朝插槽的紅色面。當電被轉移時，它會產生熱量。在水箱的壹邊放壹塊冰降溫。壹般用60轉2 h或40轉3h(6)旋轉後，用1×李春洪染料溶液染膜5min(在脫色搖床上搖勻)。然後用水沖洗掉未染色的染料溶液，就可以看到膜上的蛋白質了。將膠片晾幹備用。/ h3 P" o9 d8 n% U8 X. R
(5)免疫反應
(1)將膜自下而上用TBS浸泡後，移至盛有密封液的平皿中，在脫色搖床上室溫振搖1h。
(2)用TBST將壹抗稀釋至適當濃度(在1.5毫升離心管中)；撕下壹張大小合適的保鮮膜鋪在實驗臺上，用水浸泡四角，保持保鮮膜平整；將抗體溶液加入塑料包裝中；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘液，將膜蛋白面朝下放在抗體液面上，傾斜膜的四個角，驅除殘留氣泡；室溫孵育65438±0 ~ 2小時後，用TBST室溫洗滌兩次，每次65438±00分鐘。用TBS再次清洗10分鐘。(3)如上制備二抗稀釋液並與膜接觸。室溫孵育1 ~ 2h後，在脫色搖床上室溫用TBST洗兩次，每次10min；再次用TBS洗滌10分鐘進行化學發光反應。
(6)化學發光、顯影和固定
將等體積的試劑A和試劑B混合在保鮮膜中；65438±0分鐘後，膜蛋白與該混合溶液充分接觸，面朝下；1分鐘後，將薄膜移至另壹個保鮮膜中，除去殘留液體，包好，放入x光夾中。
在暗室中，將1×顯影劑和定影液分別放入塑料托盤中；在紅光下取出x光片，用切紙刀剪成合適的尺寸(比膠片長寬大1cm)；打開x光夾，把x光放在膠片上，壹旦放上就不能動了，合上x光夾，開始計時；根據信號的強弱適當調整曝光時間，壹般為1分鐘或5分鐘。也可以選擇不同的時間進行多次壓片，以達到最佳效果。曝光完成後，打開x光片架，取出x光片，迅速浸入顯影液中顯影，出現明顯條帶後立即停止顯影。展開時間壹般為1 ~ 2 min (20 ~ 25℃)，溫度過低(16℃以下)時應適當延長展開時間。顯影後立即將x光片浸入定影液中，定影液時間壹般為5 ~ 10 min，直至膠片透明；用自來水沖洗殘留的定影液，在室溫下晾幹。
需要註意的是，沖洗定影液時，盡量取膠片壹角，不要用手指甲刮膠片，否則會影響效果。
凝膠圖像分析對膠片進行掃描或拍照，通過凝膠圖像處理系統分析目標區域的分子量和凈光密度。