近年來，隨著惡性腫瘤的高發、艾滋病的流行、化療藥物、廣譜抗生素、糖皮質激素和免疫抑制劑等藥物的廣泛使用，以及人工導管等侵入性操作、器官移植等有創診療技術的應用，由真菌所引起的感染日益成為臨床各科室面臨的巨大挑戰。
為了提高臨床診斷水平，加強真菌的檢驗能力顯得至關重要，現在臨床微生物實驗室有關真菌檢驗的常見問題匯總如下，供大家學習參考。
1、為什麽培養要設定35℃？
實驗室通常將孵箱溫度設定為35℃，是為了防止溫度的波動對細菌或真菌生長的影響。臨床常見細菌的最適生長溫度為33~37℃(嗜熱，嗜中溫菌除外，占少數)，設定為35℃時上下波動2℃對培養無影響，如設定為37℃C顯然就不合適了。至於真菌培養,要視標本來源而定。
壹般懷疑淺部真菌感染的標本如皮屑、甲屑、頭屑及毛發等分離培養於26~28℃。來源於人體深部組織的標本如痰、胸腹水、血及骨髓深部膿腫等,建議放35℃培養,是剛離體的標本在35℃更接近於人體溫度,其次臨床最常見的白念珠菌在35℃能形成更為典型的偽足樣菌落,這與血清出芽試驗在35℃做是同樣的道理。
同時,來源於35℃初分離的光滑念珠菌具有更高的酶活性。懷疑溫度型雙相真菌感染或個別真菌需要較高溫度生長時則需要兩種溫度同時培養。還要註意培養環境的濕度,壹般要求大於60%,如果培養箱的濕度不夠,最好在平板附近放置盛有無菌水的容器以保證濕度。
2、CO2對真菌生長影響大嗎?
真菌屬於異養型微生物，主要從有機化合物中獲得碳源,而自養型微生物才需要從CO2中獲得碳源，所以真菌壹般不需要在二氧化碳環境中培養，而且CO2對真菌的生長和繁殖均不利,但壹定濃度可刺激孢子形成。
3、在血培養中培養出真菌2次，但是患兒沒有臨床表現，而且臨床也沒用抗真菌藥患兒就好了，是考慮汙染嗎?
這種情況要判斷是否為汙染菌，調查采血過程是否規範、血瓶轉運過程是否符合要求、針孔是否適當封口、轉運箱是否受到汙染等眾多因素，最關鍵的還是患者的臨床表現，如沒有真菌感染的癥狀，要麽考慮汙染，要麽考慮定植(可能性不大)。
4、我們基層醫院實際工作中做陰道分泌物真菌培養，生化鑒定幾乎做不了，很多直接報白念珠菌，這樣合適嗎？
這樣做不合適。目前有些檢驗科甚至分不清酵母菌和黴菌，在陰道白帶、尿液和糞便中鏡檢發現念珠菌後報告為“找到黴菌”。
黴菌是指絲狀多細胞真菌；酵母菌是指單細胞形態的真菌，二者不可混為壹談。陰道中感染的酵母菌大多是白念珠菌，但不排除其他酵母菌。
克柔念珠菌對氟康唑和5-氟胞嘧啶天然耐藥，如果遇到類似存在天然耐藥的菌株，會影響後續的治療。
5、痰標本中少量念珠菌需要在報告中體現嗎?還是不報告?
標本要求和檢驗程序用要體現，臨床醫生會綜合考慮。雖然白色念珠菌導致肺部真菌感染的概率很小，遇到痰標本真菌培養中分離出該真菌，還是建議報告，臨床醫生結合影像學結果綜合考慮。
先進性痰標本直接塗片，標本質量合格的情況下，見到真、假菌絲或大量孢子，痰培養有真菌生長，還是要報給臨床醫生，臨床醫生會綜合考慮的。至於是否要做藥敏，可和醫生溝通後決定。
①建議留樣本前5%蘇打水漱口；
②清晨第壹口痰；
③連送3d結果是否壹致。
最好和臨床醫生溝通壹下,或平時對醫生、護士進行標本采集方法的培訓。報告之前,結合痰塗片鏡檢結果,備註標本質量信息及汙染可能性。
6、請問壹下：前幾天遇到壹個抽出的膿液標本，打到血培養中，報陽後塗片顯示真菌孢子，轉種後塗片，形態上圓形，墨汁染色陽性，但是沒有莢膜，轉種科瑪嘉沒有顏色，後有白色有點黃色，用某國產鑒定顯示近平滑，藥敏全耐。問題是:①這個結果可信不?②墨汁用的是普通汁有影響嗎?③該如何改進?
墨汁染色是針對標本中懷疑隱球菌屬的莢膜進行負染，特別是新生隱球菌才做的試驗，對純培養的隱球菌屬不可作為鑒定試驗。
(1)將之前的膿液標本做個10%KOH濕片檢，尋找真菌孢子和真、假菌絲。
(2)培養結果應該是可信的，最好和臨床醫生溝通壹下，看患者是否有癥狀。
(3)對某國產品牌不熟悉,鑒定結果和藥敏結果不好判斷
(4)按照全國操作規程配制念珠菌的鑒定生化管，用原衛生部質控真菌鑒定符合率還是很好的，可以考慮自配生化鑒定管，用質控真菌進行驗證。
(5)對每批號的某國產鑒定管用質控真菌進行驗證,如果結果符合,應該沒問題。
(6)最好參加原衛生部微生物質控培訓，無論細菌、酵母菌方面,都會幫助妳提高業務水平和驗證妳所用的試劑質量。
(7)墨汁只要粗細均勻，顆粒越細小越好，推薦曹素功墨汁，試劑公司也有印度墨汁可采購。
7、臨床常見痰標本初次檢出曲黴後,流程是怎麽進行下去的?
(1)痰標本初次培養出絲狀真菌菌落，前提是痰標本必須是新鮮的或不能立即送檢應4℃冰箱保存。
流程是接受痰標本→鏡檢→培養→鑒定。
在痰標本合格的情況下,先做個10%KOH濕片鏡檢,低倍鏡尋找真菌菌絲，是透明或暗色，是否有45度分枝。
如果痰標本合格，又找到菌絲，電話聯系臨床，告訴醫生有絲狀真菌生長，懷疑是XXXX，容易的直接報告臨床，難的點種沙氏瓊脂平板或察氏瓊脂平板，再做進步鑒定。
(2)若標本不合格或合格但標本中未見菌絲，和臨床醫生電話溝通，告知有真菌生長，讓醫生綜合考慮。鑒定正常進行,並報告臨床,備註不排除汙染可能。
8、酵母菌同化試驗為什麽放28℃而不是35C?同化試驗和發酵試驗有何區別?為什麽教科書上說凡能發酵某種糖，壹定能同化該糖，同化某種糖則不壹定發酵該糖?
多數酵母菌體外最適生長溫度為28-30℃，故其體外試驗選用此溫度。通話和發酵分別指真菌的有氧呼吸和無氧酵解，前者將糖類分解為二氧化碳和水，後者將糖類分解為二氧化碳和酒精等。
其代謝首先進行的是有氧呼吸獲得能量，再進壹步進行無氧酵解，這由細菌和真菌的相關酶類決定。酵母菌多數為專性需氧菌，所以其試驗設計多以糖同化試驗為主。比如隱球酵母只能進行有氧呼吸，所以只能同化葡萄糖而不能發酵，而釀酒酵母可將糧食發酵為酒，既發酵也同化葡萄糖。
9、鑒於目前真菌培養不是很規範，如何選擇培養基、溫度、報告時間和方式?請講述實驗室的具體流程。
(1)培養基：沙氏葡萄糖瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、腦心浸膏瓊脂等適宜真菌生長的培養基，臨床疑似酵母菌及酵母樣菌感染，有條件實驗室可平行接種顯色培養基，推薦采用螺口管斜面培養法，標本處理後接種於培養基斜面中下部，絕大多數為需氧菌建議平行接種兩管。
(2)培養條件及報告時間：深部真菌28±1℃培養7~14d，如懷疑雙相真菌感染，應同時在28士1℃及35士1℃培養。
懷疑罕見真菌慢生長真菌感染或臨床已用抗真菌藥物時，延長觀察時間至少培養4周。
如CSF宜置28℃及35℃兩個溫度培養至少壹周；
痰/尿/糞壹般35℃48h即可，如未見絲狀真菌生長，則延長培養時間；
組織標本壹般30℃，2~4周。
10、是否可以用科瑪嘉顯色培養基作為真菌初代培養基?
可作為初代培養基之壹，建議另外接種沙氏培養基或酵母氮培養基(YPDA)，SDA和YPDA壹般是酵母樣菌的標準培養基。
11、咽拭子真菌培養有意義嗎?
咽拭子培養真菌意義不大，存在定植除非患者有臨床表現。
12、請問痰標本念珠菌定植率那麽高，痰塗片看到比較多的孢子和假菌絲要怎麽報告才比較合理?
個人覺得還是要如實報告臨床醫生、並將標本質量是否合格告知臨床醫生，至於是否感染，臨床醫生會根據影像學資料、患者臨床表現等綜合考慮的。
13、患者的手上有濕疹壹樣的丘疹,懷疑真菌感染,請問怎麽樣采樣好?
對於皮損類的標本采集，需要用70%的酒精先將患處消毒處理，再使用已消毒的不銹鋼刮刀或外科手術刀在皮損邊緣刮取皮屑，裝在無菌容器內送檢。
14、我們用壹次性手套裝SDA平板可以嗎?
壹次性手套無論是PV還是乳膠，都會產生相對低氧的環境，而真菌是需氧菌會影響真菌的生長，不建議這樣操作。
可以使用透氣性好的膠帶(靜脈輸液固定針頭的)封閉平板，註意不要封太死。
15、用的墨汁在顯微鏡下不是均勻的黑色背景，而是壹些細小黑色顆粒，這是不是墨汁的質量不好?還有,生物安全櫃、超凈工作臺和通風櫃三者有什麽區別?
墨汁本身就是壹些細微小顆粒加入溶媒形成的，墨汁質量的好壞在於顆粒的大小和均壹性。
壹般的墨汁檢測隱球菌應該能觀察，它只是作為背景,莢膜不染色，為透明的，背景是黑色。
生物安全櫃和超凈工作臺的區別在於風吹的方向：
生物安全櫃的風向是先垂直向下再向櫃內，經過循環通過HEPA過濾後再排出，櫃內形成壹個相對負壓的環境；
超凈工作臺的風向是先向下再向外吹，保證櫃內的清潔無塵，通常用來配置平板和操作壹些簡單的分子克隆相關實驗。
通風櫃是通過風機將櫃內的空氣排到實驗室外，通常用來配置有揮發性的化學品試劑，有害氣體排向室外。
16、痰塗片中看到曲黴頭，有多大臨床意義?毛黴有沒有汙染可能？或者是定值？在痰裏壹直檢查到青黴菌,沒有意義嗎?
如果痰標本直接鏡檢發現曲黴頭，那就要考慮是曲黴感染。培養可以確定是哪壹種曲黴。
毛黴存在汙染的可能性，空氣中也可以存在，但又因其高度的侵襲性，報告需謹慎，定值的可能性很小，但操作中汙染的情況還是不少的。若標本合格，濕片鏡檢有90度分枝及粗大、不分隔的菌絲，那就要考慮了，否則有汙染可能，最好及時聯系臨床醫生。
青黴菌是壹種條件致病真菌，如果痰中直接鏡檢查到菌絲，培養陽性，還是考慮感染。
17、在經驗積累的初期，如何得到足夠的菌株，用於練習各類染色、閱片呢?
有條件的話，最好到相關醫院真菌室進修學習濕片鏡檢、真菌鑒定，將保存的菌株分批轉種後，仔細研究其菌落顏色、大小質地等變化和鏡檢變化，並做好筆記。或參加醫學真菌專業培訓班進行系統學習。
18、如何保存真菌菌株?
最好的方法就是真空幹燥、低溫凍存。國際菌株保藏機構都是這種方法。
(1)將生長的斜面直接放在-10℃冷凍，表皮癬菌和許多接合菌綱菌種不可用此法保存。
(2)蒸餾水保存法：將生長在馬鈴薯葡萄糖培養基上的成熟的菌落，刮取菌絲體、芽孢或酵母細胞或利無菌蒸餾水沖洗斜面表面，再以吸管吸取放在無菌小管中，密封阻止蒸發，置於室溫保存。
(3)另壹種方法為直接加無菌礦物油至黴菌生長的瓊脂斜面，至少可保存半年以上。
(4)基礎液體培養基中加入15%~30%甘油，將新鮮成熟菌落挑至其中，-80℃保存。
19、壹般什麽樣的患者我們會重點去關註是否為真菌感染呢?
免疫缺陷病患者、器官移植患者、腫瘤患者、中性粒細胞減少患者患者及較長時間使用廣譜抗生素的患者。
20、黴菌培養箱(28C)被汙染後如何處理?培養基放進培養箱後很快長汙染菌，尤其門上的密封條上也長菌了，怎麽辦?
斷電後，甲醛熏蒸,5%苯酚(石炭酸)擦拭後停留30min後，清水擦拭，打開通風24h後再使用。
21、血培養中可能培養出哪些絲狀真菌?哪些是汙染?
血培養陽性的絲狀真菌主要有組織胞漿菌、馬爾尼菲藍狀菌、鐮刀菌、念珠菌、隱球菌、毛孢子菌、賽多孢，人眼球組織(研磨後打入血培養瓶)裏曾培養出紫色擬青黴。腹水打入血培養瓶培養出棕黑腐殖黴。
文獻報告皮炎芽生菌、伊蒙菌、球孢子菌都可以從血培養裏培養出來。
煙曲黴是汙染的,有報告土曲黴的心內膜炎患者外周血培養出來土曲黴[ I Clin Microbiol.1998Nov;36(11):3347-51]。
22、呼吸科患者，男，61歲，診斷支氣管肺炎，HIⅣ陰性，在合格痰內培養出馬爾尼菲藍狀菌3+，可以診斷嗎?有必要復檢嗎?
他肝脾大嗎?是否有骨骼受累及?皮膚受累及?還是僅僅局限在肺部?患者有其他基礎疾病嗎?
建議重送標本，如果反復培養出馬爾尼菲藍狀菌要警惕。痰中培養出馬爾尼菲藍狀菌，應該可以認為是致病性真菌。
馬爾尼菲藍狀菌和曲黴菌絲區別：
如果在直接的臨床標本中(體內)，馬爾尼菲藍狀菌是酵母樣的孢子，而曲黴菌是分枝分隔成45度角的菌絲。
如果在體外28℃培養物馬爾尼菲藍狀菌可為淡黃色、黃綠色，背面紅色，有紅色色素滲透培養基中；
而曲黴開始為白色，表面可為不同顏色的顆粒，以此區分為何種曲黴。
馬爾尼菲藍狀菌可以見到帚狀枝，而曲黴可以看到曲黴頭。
以上內容來源：盧洪洲、錢雪琴、徐和平主編的《醫學真菌檢驗與圖解》
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