從開始到20世紀90年代，美國國家美術館收藏的藝術品大約有4萬多件。其中有達·芬奇的《吉內夫拉·德本奇像》、拉斐爾《聖母圖》、凡·愛克的《聖母領報圖》，還有包括安吉利科修士、彼埃德羅·德拉·弗朗西斯卡、貝利尼、倫勃朗、馬奈、莫奈等歐洲古典藝術大師的作品。美國著名畫家斯圖爾特的《華盛頓像》、薩維奇《華盛頓的壹家》等名畫亦在畫廊中熠熠生輝。美國著名畫家科普利、伊肯斯、霍默等人的作品同樣引人矚目。在第二層展覽區，各類展廳分為威尼斯及意大利北方文藝復興時期繪畫、佛羅倫薩及意大利中部文藝復興時期繪畫、17-18世紀意大利繪畫、西班牙繪畫、佛蘭芒和德國繪畫、17-18世紀法國繪畫、19世紀法國繪畫、美國繪畫、英國繪畫等相對集中的主題，向參觀者展示藝術大師的珍品。