李時珍曾認真閱讀和研究過神農的《本草綱目》、《唐本草》、《證本草》等藥物學名著。壹方面，他欽佩前人的研究成果；另壹方面，這些著作還存在壹些理論和觀測上的錯誤，需要進行整理和糾正。
而且，從宋代《本草綱目》的修訂到李時珍生活的明代，歷史已經前進了500多年。金元以來洋藥的傳入和各種藥物學流派的紛爭，極大地完善了醫學理論。而且偏方的損失會盡快補回來。這壹切都需要整理出來，寫成新藥，這個擔子就落在了李時珍的肩上。
基於以上所知，年僅二十多歲的李時珍決心整理、補充、撰寫壹些更為詳盡的藥學著作。但他心裏很清楚，修訂本草，力求在前人的基礎上有所突破和發展，並不容易。為此，他開始了幾十年的準備工作。
為了繼承前人的科學成果，李時珍查閱了大量的歷史典籍、醫學典籍和各種本草。李時珍除了認真精讀歷代本草外，還廣泛閱讀各種醫學書籍和方劑，如《黃帝內經》、《黃帝內經·靈樞》、張仲景《傷寒論》、方、方、張仲景《金匱要略》和的《開元廣書》。並對這些作品的內容進行了回顧、檢查、分析和判斷。李時珍在閱讀大量醫學典籍的同時，還翻閱了許多古今典籍和有關官員的小說。
約1556(明嘉靖三十五年)，禮部命各地選拔醫學人才集中在北京，以彌補太醫院的空缺。湖廣走了壹批名醫，李時珍是其中之壹。
李時珍到了北京後，雖然沒有得到統治者太多的重視，但得益於太原豐富的藏書和國內外的各種藥材，他受益匪淺。他還多次到王耀寺仔細辨認銅像的人體穴位，熟悉了人體的所有穴位和經絡的原理，為他寫《奇經八脈考》等書奠定了基礎。李時珍還經常光顧太醫院的壽藥房和禦藥房，對來自不同地區的各種藥物進行比較研究，積累了豐富的藥物鑒定經驗。
李時珍在太醫院的時候，幾次向朝廷申請支持他編纂《本草綱目》，都沒有結果。於是，他辭去了在太極醫院的職務，踏上了南歸之路，決心獨立完成《本草綱目》的編纂。
用豐富的理論知識編寫壹個大規模的藥學著作目錄是遠遠不夠的。寫作之初，李時珍按照自己的分類方法，將收集到的材料逐項整理。然而，隨著研究的深入，他感到越來越困難。最令他不解的是，許多藥物的形狀和生長在古籍中往往模糊不清，有些甚至相互矛盾。經過壹番苦思冥想，李時珍終於認識到，解決這些問題的唯壹辦法就是深入民間，采集標本，進行實物考察。
李時珍的足跡踏遍了蘄春壹帶的山山水水，無牙山、崖頭山、紫雲洞、朱家洞等都成為他走訪的對象。他仔細觀察和研究了洋甘菊、苦參、紫蘇、蒼耳...還有山裏的地蜂、蟾蜍、竹子、野豬。
為了收集有價值的標本，深入了解古人所說的各種藥物，李時珍去過武當山采藥，也去過藥材豐富的佘山、茅山、牛首山。他爬山梁，下山谷，踏足袁野，到水鄉，足跡遍布湖廣、江西、江蘇、安徽等省。
在四處尋找的過程中，李時珍結交了大量的民間朋友，從他們那裏獲得了很多書本上學不到的知識。遇到農民，他問糧食的生態和屬性；每個漁民都詢問魚、蝦、龜、蟹的捕獲和食用情況；見到獵人就問野生動物鳥類的生活習性和藥用價值。遇見樵夫，聊起植物的形狀和采摘的季節；向農民詢問藥材的采集和釀造情況；向果農了解果蔬的種植、嫁接和品種口味。通過廣泛的咨詢和實地考察，李時珍糾正了前人的許多錯誤觀點。
為了徹底了解藥物的功效，李時珍經常嘗試藥物，甚至幾次險些中毒而死。