1)稀釋問題
純菌株分離時，無非是將菌液稀釋到壹定梯度，塗在LB培養基上。如果稀釋不好，會導致細菌生長過密，或者細菌根本就不生長。最佳稀釋梯度是平板上的菌落數在30和300之間。此時可以清楚地看到菌落的形態，便於挑取單個菌落；
2)雜菌汙染問題
因為壹般采用營養豐富的有機培養基進行接種，所以這種培養基適合任何細菌的生長。在操作的過程中，空氣中和桌子上會有很多看不見的菌勢。分離接種前，所有使用過的儀器和培養基必須在121攝氏度下滅菌20分鐘至30分鐘。倒平板時，最好在培養基還熱的時候倒，以減少雜菌的感染。所有操作最好在幹凈的工作臺上進行。如果沒有潔凈工作臺，用兩個酒精燈點亮，用酒精擦拭桌面，在兩個酒精燈之間操作。
綜上所述，要做好細菌的隔離和接種，操作人員必須完全保證雜菌的感染，操作熟練，對溫度和清潔度要求最嚴格。