小鼠骨髓瘤細胞中沒有S通路，用氨基嘌呤阻斷D通路後可以清除。只有雜交瘤細胞在用氨基嘌呤阻斷D通路後，才有S通路，所以可以繼續分裂。
小鼠腹腔細胞中含有巨噬細胞，巨噬細胞不僅能攝食，還能清除死亡和破碎的細胞及微生物。將8 ~ 10周齡的同品系小鼠斷頭處死，無菌操作下腹腔註射10 ~ 15 ml完全培養液。用無菌拇指摩擦腹部數次後，將腹腔液吸回，將細胞濃度調至1×105/ml。壹般壹只小鼠腹腔液可獲得3 ~ 5× 106個細胞，可用於壹次融合。也可以混合兩種小鼠腹腔巨噬細胞。此外，同源小鼠的脾細胞和胸腺細胞也可用作飼養細胞。
PEG處理後，選擇性培養的兩種親代細胞可以形成各種細胞成分的混合物，包括未融合的遊離親代細胞、骨髓瘤細胞之間的融合、免疫B細胞之間的融合以及骨髓瘤細胞和免疫B細胞之間的融合。只有後者能形成雜交瘤，應篩選出來進行克隆和培養。通常使用HAT培養基，它含有次黃嘌呤H、氨基蝶呤A和胸苷t。
大多數實驗室在融合當天，或第二天加入HAT培養液。壹般在融合後7 ~ 14天內用HAT培養基，然後用HT培養基。融合後第2 ~ 3周換液，將培養孔中1/2的舊液吸出，換上新液。之後3 ~ 5天換液1次，2周。3 ~ 5天後，未融合和自融合的細胞逐漸死亡，1周左右可出現克隆，並繼續增殖。當孔底菌落>:3mm或1/2時，可取上清液進行抗體活性檢測，同時可加入新鮮HT培養液。在壹個好的融合試驗中，約70 ~ 80%的氣孔有克隆生長。所有生長克隆的孔都需要取培養上清液用於抗體活性檢測。培養3周後，即可使用普通完全培養液。