通過細菌操作用接種環蘸取少量待分離物質，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續劃線。隨著劃線次數的增加，微生物細胞數量會減少，逐漸分散。如果劃線適當，可將微生物逐壹分散，培養後可在平板表面獲得單菌落。
二、稀釋倒置平板法
先將待分離的材料用無菌水稀釋壹個系列(如1: 10，1: 100，1: 1000，1: 1000 …)。搖勻，倒入已滅菌的培養皿中，待瓊脂凝固後，做成可能含有細菌的瓊脂平板，保溫壹定時間，得到菌落。如果適當稀釋，在平板表面或瓊脂培養基中可能出現分散的單個菌落，這可能是由細菌細胞的繁殖形成的。然後挑單菌落，或者重復幾次以上操作，得到純培養。稀釋塗布法:
優點:可以統計和觀察菌落特征。
缺點:吸收少，麻煩多，不幹燥效果差，容易散開。
壹般用來統計平板培養基的回收率！
稀釋混合平板法:
優點:可計數，吸收容量1ml，方便。
優點:無法觀察到菌落特征。
壹般用於計數菌落總數！
平板劃線方法:
優點:可以觀察菌落特征，分離雜菌！缺點:不能算。