生長良好的培養細胞、新鮮培養基、DMSO(適馬D-2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4% (w/v)臺盼藍(Gibco BRL 15250-061)、血細胞計數盤和蓋玻片、等速。
2、冷凍保存方法:
(1)傳統方法:將蓄冷管置於4℃10分鐘→- 20℃30分鐘→- 80℃16 ~ 18小時(或過夜)→液氮罐長期保存。-20℃的溫度不要超過1小時，以免冰晶過大導致細胞大量死亡。也可以跳過這壹步，直接放入-80℃冰箱，但存活率略有下降。
(2)程序降溫:采用程序等速降溫機，以-1 ~-3℃/min的速度從室溫降至(低於-80℃) -120℃，然後在液氮槽氣相中長期保存。適用於懸浮細胞和雜種的保存。
3.步驟:
(1)冷凍前壹天更換壹半或全部培養基，觀察細胞生長情況。
(2)冷凍保存液的配制(使用前配制):在新鮮培養基中加入DMSO，終濃度為5 ~ 10%，混勻，室溫放置備用。
(3)按照細胞傳代培養的操作，收集培養的細胞，取少量細胞懸液(約0.1ml)，計數細胞濃度和凍存前的存活率。
(4)離心，除去上清液，加入適量的凍存液，使細胞濃度為1 ~ 5× 106個細胞/ml，混勻，分裝於完全貼標簽的凍存管中，1ml/瓶，取少量細胞懸液進行汙染檢測。
4.註意事項:
(1)待凍存的細胞應處於對數期良好、存活率高的狀態，密度約為80-90%。
(2)在冷凍之前，測試細胞是否仍然保留其獨特的性質。例如，雜交瘤應該在冷凍前壹至兩天檢測抗體是否產生。
(3)註意冷凍保護劑的質量。DMSO應為試劑級，無菌無色(用0.22micron FGLP Telflon過濾或直接購買的無菌產品，如適馬D-2650)，分裝於5 ~ 10 ml小體積中，避光4℃保存，多次不解凍。甘油也要試劑級，高壓蒸汽滅菌，避光保存。如果開封後壹年內使用，長期存放會對細胞產生毒性。
(4)冷凍保存的細胞濃度:
①正常人成纖維細胞:1 ~ 3×106細胞/毫升
②雜交瘤:1 ~ 3× 106細胞/ml，細胞濃度不宜過高。由於冷凍濃度高，壹些雜種在解凍24小時後會死亡。
③粘附瘤株:5 ~ 7× 106，視細胞類型而定。腺癌解凍後需要更高的濃度，而HeLa只需要1 ~ 3× 106細胞/ml。
④其他懸液:5 ~ 10× 106細胞/ml，人節律至少要5×106細胞/ml。
(5)冷凍保護劑的濃度為5或10% DMSO。如果細胞的冷凍條件不確定，應在凍存的同時進行備份培養，以防冷凍失敗。
第二，冷凍細胞的激活
1.冷凍細胞的激活原理是快速解凍，避免冰晶重結晶對細胞的損傷和細胞的死亡。
2.細胞被激活後，需要幾天，或者壹兩代，它們的細胞生長或特性才會恢復正常(例如產生單克隆抗體或其他蛋白質)。
3.材料:37℃恒溫水槽、新鮮培養基、無菌吸管/離心管/培養瓶、液氮或幹冰容器。
4.步驟:
(1)操作人員應戴防護口罩和手套，以防凍結管爆裂。
(2)從液氮或幹冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否擰緊。因為熱脹冷縮的過程，這個時候蓋子很容易松動。
(3)將新鮮培養基放入37℃水槽中加溫，加溫後噴70%酒精擦拭，移入無菌手術臺上。
(4)取出凍存管，立即放入37℃的水槽中快速解凍，輕輕搖動凍存管，使其在65438±0分鐘內完全融化，用70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌手術臺上。
(5)取出解凍後的細胞懸液，緩慢加入裝有培養基的培養容器中(稀釋比為1:10 ~ 1:15)，混勻，放入CO2培養箱中培養。取0.1毫升解凍後的細胞懸液進行存活試驗。
(6)解凍後是否立即去除冷凍保護劑(如DMSO或甘油)取決於細胞類型。壹般來說，沒有必要立即去除防凍劑。但是，如果要立即去除，將解凍的細胞懸液加入含有5-10ml培養基的離心管中，以1000rpm離心5分鐘，去除上清液，加入新鮮培養基，混勻，放入CO2培養箱中培養。
(7)如果不需要立即去除冷凍保護劑，則在解凍培養後每隔壹天更換培養基。
第三，細胞計數和存活試驗
1，原則:
(1)細胞數可通過血細胞計數盤或Coultercounter顆粒計數器自動計數。
(2)血細胞計數盤壹般有兩個腔室，每個腔室精雕九個1mm2的正方形，四個角的正方形精雕16個細胞，深度均為0.1mm。當蓋玻片蓋在腔體上方時，每個大方塊的體積為1 mm2×0.1mm = 1.0x 10-4ml。使用時，統計每個大方塊的細胞數，乘以稀釋倍數，再乘以104，就是每毫升的細胞數。
(3)存活試驗的步驟是染料排除法，染料會滲入死細胞而變色，而活細胞不會變色，因為細胞膜完好無損，染料無法滲入。壹般使用藍色臺盼藍染料，如果細胞不易吸收臺盼藍，則使用紅色臺盼藍染料。
2.材料:
0.4%w/v臺盼藍(gibco br 15250-061)；紅色素藍染劑；將0.1克赤蘚紅藍(Sigmae-9259)和0.05克防腐劑對羥基苯甲酸甲酯(Sigmah-3647)溶解在100毫升ca++/mg++遊離鹽水中；血細胞計數盤和蓋玻片；壹個櫃臺；低倍倒置顯微鏡；粒子計數器(Coulter Electronics)。
3.步驟:
(1)取50 μ l細胞懸液和50μl臺盼藍(Orerythrosinblue)，在1.5ml的小離心管中混合均勻
(2)從血細胞計數盤的腔室上方的凹槽中加入少許混合液(約15μl)，用蓋玻片蓋住，在100倍的倒置顯微鏡下觀察。活細胞不染色，死細胞呈藍色(或紅色——赤蘚紅藍)。
(3)數四個大方塊中的細胞總數，除以4，乘以稀釋倍數(至少2，因為是和臺盼藍等體積混合的)，最後乘以104，就是每毫升細胞懸液中的細胞數。如果單元格位於該行，則只計算該行和右行的單元格(或該行和左行的單元格)。
註:4細胞總數×稀釋倍數×104/4=細胞數/ml；每個網格的體積= 0.1cm×0.1cm×0.01cm = 10-4ml。
4.示例:
T75單層培養制成10ml細胞懸液，將0.1ml溶液與0.1ml臺盼藍在試管中混合均勻，在血細胞計數盤中加入少許混合液，計數四個方格中的細胞數。
活細胞/網格數:55，62，49，59；死細胞/網格數:5，3，4，6；細胞總數=243
平均細胞數/平方= 60.75；稀釋倍數=2
細胞數/ml: 60.75× 104× 2(稀釋倍數)=1.22×106。
細胞數/瓶(10ml):1.22×106×100ml = 12.2×106。