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免疫檢測方法有哪些?

(1)放射免疫分析。RIA技術是利用放射性同位素(如125I、32P、3H等)標記抗原或抗體的技術。)用γ射線探測器或液體閃爍計數器測量γ射線或β射線的放射性強度,以確定抗體或抗原的量。它包括以標記抗原為特征的放射免疫分析和以標記抗體為特征的免疫放射分析(IRMA)。前者多采用液相競爭結合法,大分子抗原和小分子抗原均有測定;後者主要用固相法檢測大分子抗原。

RIA在早期建立的農藥免疫分析方法中占有很大比重。建立了狄氏劑、艾氏劑、2,4-D和2,4,5-T、對硫磷和百草枯等農藥的放射免疫測定方法。雖然這種方法的靈敏度非常靈敏(RIA通常為10-9g,10-12g,甚至10-15g),但其在農藥殘留檢測領域的應用和發展壹直受到限制,但RIA需要昂貴的計數器,還存在輻射和汙染等問題。

(2)酶免疫分析。EIA是在RIA之後發展起來的免疫測定技術。其檢測原理與放射免疫法相似,但使用的標記物是酶,將抗原和抗體的特異性免疫反應與酶的高效催化作用有機地結合起來,通過測量結合在固相上的酶的活性來確定被檢測物質的量。用作標記的酶包括辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AKP)、葡萄糖氧化酶(GO)、脲酶等。酶標記反應的固體支持物包括聚苯乙烯塑料管、膜等。目前多采用96孔酶標板(MTP)作為固相支持物。這種平板檢測容量大,樣品數量多,只需要簡單的酶標儀就可以獲得準確的檢測數據。也有學者將磁珠作為固相材料用於EIA研究。原理是高分子材料(聚苯乙烯、聚氯乙烯等。)包裹在金屬小顆粒(Fe2O3、Fe3O4)外面,然後通過化學鍵合氨基(- NH2)、羧基(- COOH)、羥基(-OH)等活性基團,再偶聯抗體或抗原制成免疫微球。這種方法的優點是微珠比表面積大,吸附能力強,可以懸浮在液相中快速均勻地捕獲樣品中的待測物質,通過施加磁場,微珠可以快速地從樣品溶液中分離出來,從而減少檢測時間,提高檢測靈敏度。

由於酶標試劑制備簡單、穩定、廉價,而且酶免疫分析的靈敏度接近放射免疫分析的靈敏度,近年來EIA技術發展迅速,發展了許多EIA方法。其中,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是農藥殘留檢測中應用最廣泛的酶免疫分析技術。

(3)熒光免疫分析法。FIA檢測的基本原理是將抗原和抗體的高度特異性與熒光的靈敏度和可測性有機結合起來,利用熒光物質作為示蹤劑標記抗體、抗原或半抗原,制備高質量的特異性熒光試劑。當抗原抗體偶聯物中的熒光物質受到紫外光或藍光照射時,可以吸收光能,進入激發態。當它從激發態回到基態時,能以電磁輻射的形式發射吸收的光能,產生熒光。繪制農藥濃度-熒光強度曲線,可以定性和定量檢測樣品中的農藥殘留。

適用於抗體、抗原或半抗原的分子標記的熒光素必須滿足以下要求:①應具有能與蛋白質分子形成穩定價鍵的化學基團,或在不破壞其熒光結構的情況下容易轉變成此類反應形式;②標記後,熒光素和抗體或抗原的化學結構和性質沒有改變;③熒光效率高,與蛋白質結合的要求很小;④熒光素與蛋白質的結合過程簡單快速,遊離的熒光素及其降解產物易於去除;⑤偶聯物在壹般儲存條件下性能穩定,可長期儲存。

(4)發光免疫測定法(LCIA)。LCIA可分為化學發光免疫分析法(CLCIA)和生物發光免疫分析法(BLCIA)。

1976年,Shroeder首先建立了生物素(b)-親和素(a)體系的均相化學發光免疫分析技術,後由Halman和Velan擴展到非均相體系,現已滲透到生物學研究的各個領域。其原理是通過發光來指示抗原和抗體的結合。當發光標記與相應的抗體或抗原結合後,底物與酶反應,或與發光劑發生氧化還原反應,或激發熒光物質(如紅熒烯等。)來釋放光能。最後,用光度計測量發光強度並進行定量分析。常用的發光標記物有ABEI辣根過氧化物酶(HRP)、魯米諾、異魯米諾、洛芬酯、熒光素、雙(2,4,6-三氯苯)草酸酯、二酚和6[n-(4-二氨基丁基]-]。當用發光標記物標記的抗體(或抗原)在壹定pH緩沖溶液中與相應的抗原(或抗體)結合後,在協同因子(如H2O2等)的作用下發光。),其發光強度與被檢測物質的濃度成正比,因此可用於定量分析。

發光免疫分析具有特異性強、靈敏度高(檢測限為10-15mol/L)、快速(1 ~ 3h)、發光材料易得等優點。但其發光過程和發光強度往往受發光物質本身的化學結構、介質的酸堿度、協同發光物質和金屬離子雜質的影響。

(5)膠體金免疫層析法(GICA)。GICA檢測的原理是將配體(抗體或抗原)以線性包被的方式固化在硝酸纖維素膜等微孔膜上,將膠體金標記物與配體或其他物質壹起固定在幹燥狀態下的吸水材料上,使樣品溶液通過毛細管作用在層析片上遊動。當遊至膠體金標記時,若樣品中含有待測受體,則發生第壹次高度特異性的免疫反應,形成的免疫復合物繼續遊至線性包被區。第二次高特異性免疫反應發生,形成的免疫復合物被截留在包被的線性區域,並通過標記的膠體金呈現紅色條帶(檢測帶),而遊離標記穿過檢測帶,自動與結合標記分離。通過檢測帶2上顏色的存在或不存在或顏色的深度,可以實現定性或定量的確定。

2金標試紙檢測

GICA法具有快速(5~20min)、廉價、結果確切、不需要復雜的操作技能和特殊設備、便於攜帶等優點。但與其他免疫分析方法相比,該方法的檢測靈敏度略低,主要適用於現場快速定性或半定量測定。目前,該方法已應用於醫學、生物學等多個研究領域,尤其是在發達國家。

(6)免疫分析和儀器分析相結合的技術。使用單壹IA技術進行農藥殘留分析獲得的信息較少,理化分析方法的選擇性較差。Kramer等人將免疫分析與液相色譜(LC)相結合,簡化了分析方法,提高了檢測效率。LC和IA的結合將LC的高分離能力和IA的高靈敏度和特異性結合起來。該方法特別適用於多組分殘留分析和痕量分析。免疫分析與氣相色譜/質譜聯用(GC/MS)可以減少農藥或結構相似的代謝物分析中的交叉反應,從而減少假陽性。

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