1
人A2ML1的冷凍電鏡結構闡明了A2M家族的蛋白酶抑制機制
人A2ML1的冷凍電子顯微結構說明了A2M家族蛋白酶抑制的機制。
A2ML1是壹種單體蛋白酶抑制劑，屬於蛋白酶抑制劑和補體因子的A2M超家族。在本研究中，作者研究了人A2ML1的蛋白酶抑制機制，並確定了其天然和蛋白水解切割構象的結構。A2ML1的功能抑制單位是壹個單體，它依靠蛋白酶的價結合(由A2ML1的硫酯介導)來實現抑制。與A2M四聚體將蛋白酶捕獲在由四個亞基形成的兩個內室中相比，在蛋白酶切割的單體A2ML1中，無序區域圍繞捕獲的蛋白酶，並可能阻止底物進入。在天然的A2ML1中，誘騙區域通過疏水通道，這表明通過切割誘騙區域來破壞這種排列會引發大範圍的構象變化，從而導致蛋白酶抑制。與C3/C4相比，A2M蛋白超家族具有這種機制，能夠觸發蛋白水解激活後的構象變化。
2
鏈球菌Siglec樣粘附素的聚糖選擇性起源提示受體適應機制
鏈球菌樣粘附素中多糖選擇性的起源表明了受體適應機制
細菌和宿主受體的結合是* *發病的基礎。許多鏈球菌使用Siglec樣結合區(SLBR)粘附在細胞表面表達的蛋白質連接的碳水化合物上。鑒定的精確聚糖庫可以確定該生物體是否是嚴格意義上的生物體而不是病原體。然而，尚不清楚是什麽驅動了受體的選擇性。在本研究中，作者使用了五個有代表性的SLBR，並鑒定了具有高序列和結構的受體結合位點。結果表明，這些區域使用嵌合體和單個氨基酸取代來控制優選碳水化合物配體的同壹性。作者進壹步評估了優選配體的身份如何影響與人類唾液和血漿樣品中糖蛋白受體的相互作用。因為點突變可以改變首選的人類受體，這些研究顯示了鏈球菌如何適應環境聚糖池的變化。
三
計算設計的超活性Cas9酶
計算設計的高活性Cas9酶
改變活細胞基因組的能力是理解基因如何影響生物體功能的關鍵，對修改生命系統以達到有用的目的非常重要。然而，這壹目標長期以來受到基因工程所涉及的技術挑戰的限制。基因編輯的最新進展繞過了其中壹些挑戰，但結果並不令人滿意。在本研究中，作者使用FuncLib計算並設計了具有顯著更高的不依賴於供體的編輯活性的Cas9酶。作者使用與酵母細胞存活相關的遺傳回路來量化Cas9活性，並發現了工程領域之間的協同作用。這些過度活躍的Cas9變體在哺乳動物細胞中發揮了有效的作用，並在目標基因組區域引入了更大和更多樣的插入和缺失池，這為增強和擴展基於CRISPR的基因編輯的可能應用提供了工具。
四
通過CRISPR/nCas9輔助的多重胞苷堿基編輯進行復雜細菌表型的模塊化(去)構建
通過CRISPR/nCas9輔助和多胞苷堿基編輯分析復雜的細菌表型。
模塊化(分解)結構
CRISPR/Cas技術構成了基因組工程的有力工具，但它們在非傳統細菌中的使用依賴於宿主因子或外源重組酶，這限制了效率和通量。在這項研究中，作者通過開發壹種廣泛適用的革蘭氏陰性菌基因組工程工具集來緩解這些實際限制。這壹挑戰通過定制CRISPR base editor得到了解決，它可以使用>:單核苷酸拆分操作(C G T A)實現了90%的效率。此外，Cas6介導的GUIDRNAs加工被整合到質粒組裝的流線型方案中，支持多堿基編輯，效率>:85%。這套工具用於構建和解構土壤細菌中惡臭假單胞菌的復雜表型。芳香化合物生產表型的壹步工程和復雜氧化還原代謝的多步解構說明了該工具箱提供的多堿基編輯的多功能性。因此，該方法克服了以往技術的典型局限性，給出了壹個至今遙不可及的革蘭氏陰性菌工程方案。
五
利用蛋白質組約束通過基因組規模建模提高酵母重組蛋白產量
利用蛋白質組約束基因組規模建模提高酵母重組蛋白產量
真核細胞作為細胞工廠，生產和分泌大量重組藥物蛋白，包括目前幾種最暢銷的藥物。由於分泌途徑的重要作用和復雜性，傳統上通過代謝工程提高重組蛋白產量是相對暫時的。並且需要更系統的方法來產生新穎的設計原則。本研究中，作者提出了壹個受釀酒酵母蛋白質組約束的基因組規模的蛋白質分泌模型，使得模擬和解釋分泌能力有限導致的表型成為可能。作者進壹步應用pcSecYeast模型預測了幾種重組蛋白的過量表達目標。許多預測的α-澱粉酶產量目標通過實驗得到驗證，證明了pcSecYeast作為計算工具在指導酵母工程和提高重組蛋白產量中的應用。
六
用於在釀酒酵母中高水平表達的體內基因擴增系統
在釀酒酵母中高水平表達的體內基因擴增系統
基因表達水平不足導致的代謝途徑瓶頸仍然是利用微生物細胞工廠進行工業生物生產的壹大難題。增加基因劑量可以克服這些瓶頸，但目前的方法有很多缺點。在這項研究中，作者描述了HapAmp，壹種利用單倍體缺陷作為進化力量來驅動體內基因擴增的方法。HapAmp可以實現高效、可滴定、穩定的外源基因拷貝整合，最多可轉移47個拷貝到酵母基因組中。以代謝工程為例，該方法可以顯著提高倍半萜橙花油、單萜檸檬烯和四萜番茄紅素的產量。檸檬烯的效價在單個工程步驟中提高了20倍，在搖瓶培養中為1g·L-1。作者還顯示了酵母中異源蛋白產量的顯著增加。HapAmp是快速解鎖代謝瓶頸的有效方法，用於微生物細胞工廠的開發。
七
以形成降冰片烯的Diels-alder酶為特征的萜烯生物合成途徑的發現和表征
降冰片烯Diels-alder酶形成的萜烯生物合成途徑的發現和表征
催化周環反應的周環酶形成了壹個不斷擴大的具有生物催化作用的酶家族。雖然越來越多的周環酶被發現，但令人驚訝的是環戊二烯和烯烴親雙烯體之間的Diels-Alder環化反應生成降冰片烯，這是合成化學中最好的環加成反應之壹，至今沒有相應的酶促反應。在這項研究中，作者報告了壹條以降冰片烯合酶SdnG為特征的途徑的發現，該途徑用於生物合成抗真菌天然產物花楸的萜烯前體。sordaricin生物合成的完全重建揭示了自然界使用的簡單氧化策略，其將完整的烴前體轉化為SdnG的高功能底物，用於分子內Diels-Alder環加成。SdnG產生花楸苷的降冰片烯核心，並加速反應以抑制活化的親雙烯體的宿主介導的氧化還原修飾。這項工作的發現擴大了周環酶催化反應和P450介導的萜烯成熟的範圍。
八
合理改造檀香烯合成酶以調整檀香油的成分比例
合理改造檀香合成酶，調整檀香油成分比例
植物精油(PEO)廣泛應用於化妝品和保健行業。PEO的組成比例決定了它們的質量。在PEO生物技術平臺的建設中，控制組件的比例是壹個挑戰。在本研究中，作者通過多尺度模擬探索了產物雜合體和產物特異性檀香合酶(SaSSy和SanSyn)的催化反應途徑。發現SanSyn的F441是限制中間體構象動力學的關鍵殘基，所以壹般堿基T298的直接去質子化主要生成α-檀香。塑料殘基的後續突變產生了突變酶SanSynF441V，可產生α-和β-檀香。通過代謝工程的努力，檀香萜/檀香酚的效價達到了704.2 mg/L，組成比例與ISO 3518:2002標準匹配的非常好。本研究為代謝與酶工程相結合，構建成分配比理想的PEO生物技術平臺提供了範例。