妳熟悉這些克隆技術嗎？我們來看看這些技術的特點。
1，限制性內切酶消化和連接法
長期以來，限制酶消化連接法被認為是壹種傳統的克隆方法。這種方法廉價靈活，可分為酶切和連接兩步。限制性內切酶可以特異性地與壹個叫做限制性內切酶識別序列的DNA片段結合，切割雙鏈DNA。DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段的相鄰5'-磷酸和3'-羥基之間磷酸二酯鍵的形成。在分子克隆中，最有用的DNA連接酶是來自T4噬菌體的T4 DNA連接酶。這種方法原理比較簡單，我就不多介紹了。
2、網關克隆技術
網關克隆在20世紀90年代末被發明，由walhout等人提出[2]。與傳統的克隆方法相比，Gateway技術的優勢在於可以根據確定的方向和讀碼框，快速準確地將目的基因克隆到與Gateway技術兼容的各種目的載體中，而無需考慮目的DNA是否有合適的限制性位點，也無需繁瑣耗時的限制性和連接反應。
它利用λ噬菌體與大腸桿菌染色體即LR和BP之間的位點特異性重組、整合和切除反應。BP反應是attB DNA片段或表達克隆與attP供體載體之間產生進入克隆的重組反應。LR反應是attR引物克隆和attR靶載體之間的重組反應。LR反應用於在平行反應中將靶序列轉移到壹個或多個靶載體上。重組位點attB、attP、attL和attR被λ噬菌體和大腸桿菌編碼的酶混合物特異性識別。
Invitrogen公司開發了適用於原核、酵母、昆蟲和哺乳動物宿主的表達載體，大大提高了Gateway技術的適用性。網關技術在高通載體建設中得到了廣泛應用。
3、吉布森裝配
傳統的限制性內切酶克隆技術會在兩個片段的結合位置形成壹個“疤痕”或“接縫”，這可能會對DNA片段的行為產生微妙的影響。對於合成生物學家來說，這是壹個特別頭痛的問題，因為他們經常需要將啟動子和終止子等DNA片段轉化為可預測的獨立元件。現在我來介紹壹下Gibson組裝，壹種無縫克隆的方法。
Gibson組裝是由丹尼爾·吉布森博士和他的同事J. Craig Venter在2009年首次提出的[3]。Gibson組裝非常適合拼接多個線性DNA片段，當然也適合將目的DNA插入載體。如下圖所示，首先需要在DNA片段的末端加上同源片段(通過PCR)；然後，將這些DNA片段與主混合物(包含三種酶)混合，並孵育壹小時。這個主混合物包含三種不同類型的酶:1)壹種核酸外切酶，它從5 '端消化DNA，產生壹個長的粘性末端，便於與另壹個同源末端配對。2)聚合酶用於修復缺口。3)DNA連接酶，實現無縫拼接，形成完整的DNA分子。
這個系統最大的好處就是三種酶在相同的溫度下都能很好的發揮作用，所以整個反應在50攝氏度的情況下可以在壹個小時內完成。壹小時後，樣品可直接用於轉化。當然Gibson組裝也有缺陷，這個過程不會產生限制性位點，所以不方便將拼接的片段轉移到另壹個載體上。建議最好提前設計限制位點。需要註意的是，如果壹次組裝5個以上的片段，成功率會大大降低。
4、金門組裝法
金門組裝法主要依靠壹種ⅱ型限制性內切酶(ⅱ型S酶，如Bsaⅰⅰ和Aarⅰⅰ)，可以切割與其DNA識別位點相鄰的位點[4]。如果人工設計具有不同識別位點的相鄰序列，同壹種限制性內切酶可以產生不同的粘性末端，從而可以壹次組裝多個片段，克服了傳統多片段組裝中限制酶類的限制。
具體到原理:內切酶壹般有三種，通常用兩種酶來識別特定的回文序列，並從其上切下。金門壹般使用bsmb 1、BSA 1、BBS 1三種酶來識別特定序列，並在特定序列後每隔幾個任意堿基進行切割，以克服兩種酶需要回文序列才能使用的缺點，實現片段連接。
另外，我想說壹下銜接部分。傳統的連接酶是T4，可以連接粘端和平端，金門用T7，特點是只連接粘端。由於T7的這壹特性，可以將片段與切割的載體混合到特殊的緩沖液中，在其中核酸內切酶和T7都可以保持高活性，並且可以通過調節溫度來構建克隆。因為使用了T7，所以不需要擔心PCR片段的自連接降低克隆效率，而且因為使用了三種酶，所以我們可以通過粘性末端的設計，用壹種酶切割多個片段，而不用擔心這些片段之間的隨機連接，從而達到分子克隆的目的[5]。
5、拓撲克隆(TA克隆)
拓撲克隆用的是DNA拓撲異構酶I，它兼具限制酶和連接酶的特性。這種酶在復制過程中切割並重新連接DNA，整個克隆過程可以在室溫下完成，只需要5分鐘。TOPO克隆可以直接進行，無需使用含有限制性酶序列的引物，也無需在PCR擴增產物中加入接頭。
Topo TA克隆原理與TA克隆相同，唯壹不同的是TA克隆使用T4連接酶將PCR片段連接到T載體上，而Topo TA克隆使用DNA拓撲異構酶I..
pCR-TOPO載體也是T載體，除了拓撲異構酶I附著在突出的T的3’末端。當3’末端帶有突出A的PCR產物與T載體互補時，拓撲異構酶I連接缺口。
距離沃森和克裏克在1953年發現DNA的雙螺旋結構只有60多年，但今天的DNA克隆技術已經發展到這樣的程度。合成生物學正處於快速發展時期，這些進步技術的進步必將推動生物革命浪潮的到來。妳都掌握了嗎？
參考
[1]李，林辰水，。不依賴連接反應的高通定量克隆方法。氨基酸與生物資源. 2013，35 (4): 43-46。
[2] Walhout A J M，Temple G F，Brasch M A，等. GATEWAY重組克隆:在克隆大量開放閱讀框或ORFeomes中的應用[J].酶學方法，2000，328: 575-IN7。
[3]吉布森，D.G .等人(2009年)納特。方法6，343-345。
[4] Morbitzer R，Elsaesser J，Hausner J，等.通過模塊化克隆組裝定制的TALE型DNA結合結構域[J].核酸研究，2011，39(13): 5790-5799。
[5]問題/49568914/答案/116646832