如何解決RAW264.7細胞的基因敲除也是海星organism-cas9x.com的重要研發方向。經過壹年多的研發，我們終於在技術上解決了RAW264.7細胞株的基因編輯問題，可以為客戶提供編輯效率高、結果穩定、周期快的基因敲除解決方案。
RAW264.7細胞中基因敲除/基因敲入/基因突變的工藝流程如下:
1.RAW264.7細胞培養條件及註意事項
RAW264.7細胞的培養條件為:DMEM高糖+10%FBS。RAW264.7細胞對血清質量要求較高，建議使用優質胎牛血清。
RAW264.7細胞有兩種狀態:
1，未激活的RAW264.7細胞:通常呈圓形，黏附力弱；
2.活化的RAW264.7細胞:活化的RAW264.7細胞壹旦受到刺激，就會長出偽足，粘附力增強，同時，細胞表面活化標誌物的表達也會增加。
因此，在RAW264.7細胞培養過程中，需要及時更換液體和傳代培養，否則饑餓細胞狀態會急劇惡化，不可逆地出現大量偽足，最後細胞生長速度會變得非常緩慢。
ATCC官方網站RAW264.7細胞培養照片。
因為我們很好的控制了RAW264.7細胞的傳代和換液頻率，RAW264.7細胞的狀態得到了很大的改善。下圖是RAW264.7的細胞狀態圖。
RAW264.7細胞培養照片
2.RAW264.7細胞轉染條件的優化
海星Bio -cas9x.com會根據每個細胞的特性優化其電轉化條件，包括電轉化緩沖液的優化。我們嘗試在電轉化緩沖液中加入壹種吸附劑，可以大大促進DNA吸附到細胞表面，同時增加緩沖液的電阻，從而提供電轉化電壓，大大提高電轉化的效率，是傳統緩沖體系的3-5倍，達到80%。同時，由於細胞存活率提高到90%，細胞的基因編輯效率也大大提高。
GFP表達載體電穿孔後72小時的比較
3.RAW264.7細胞快速克隆條件的優化:
由於使用了ClonePlus技術，RAW264.7的細胞克隆形成率可達95%以上，克隆形成時間也縮短至1-2周，大大縮短了整個克隆檢測的時間周期。(傳統的克隆過程需要1個月)
與病毒方法相比，無病毒技術具有更高的效率和更短的周期，並且可以避免病毒復制的風險。與貼壁細胞相比，懸浮細胞更難篩選耐藥性，單克隆效率低。另外，基因定點突變的效率遠低於基因敲除，由於兩者的疊加，得到突變純合子的概率極低。
ClonePlus技術，采用專有膠體表面處理，RAW264.7細胞系克隆率達95%以上，克隆PCR可輕松分離鑒定，大大提高了細胞鑒定的陽性率。