作者:215003江蘇省蘇州大學附屬兒童醫院中心實驗室？概述？基因敲除新技術——RNAi金審稿朱審稿摘要RNA幹擾(RNAi)是壹種新的基因阻斷技術，它通過雙鏈RNA分布特異性降解相應序列的mRNA，從而導致轉錄後基因沈默。自1995首次報道以來，已取得重大研究進展。在過去的八年中，研究人員對RNAi現象進行了廣泛而深入的探索和研究，這表明RNAi有望成為未來分析人類基因功能的有力工具，將在基因表達成像和人類疾病治療中發揮重要作用。RNA幹擾；基因敲除；基因沈默中國圖書館分類號:R457.4文獻識別碼:A文號:1673 24130(2007)1121016204基因敲除是壹種反向遺傳學研究方法，發展於80年代以後。壹般來說，基因敲除主要是基於DNA同源重組的原理，但這種技術比較復雜，成功率不高。隨著基因敲除技術的發展，除了同源重組，新的原理和技術也逐漸被應用，如基因插入突變和RNA幹擾(RNAi)，也可以達到基因敲除的目的。其中RNAi由於方法簡單，周期短，近年來被越來越多的用於基因敲除[1 ~ 3]。RNAi是指雙鏈RNA誘導同源mRNA降解導致基因表達受到抑制的現象，也稱為基因沈默。RNAi是壹種轉錄後基因沈默(PTGS)現象，是生物在進化過程中抵禦病毒感染和由重復序列和突變引起的基因組不穩定的壹種保護機制。RNAi現象的發現1995、Ouo等人發現註射正義RNA和反義RNA可以有效地、特異性地抑制秀麗隱桿線蟲par21基因的表達，這是反義RNA技術理論無法合理解釋的。直到1998，Fire等證實了郭等發現正義RNA抑制同源基因表達的現象是由於體外轉錄制備的RNA中混入了少量內源或外源RNA(double2s trandednar，dsRNA()所致，並將此現象命名為RNAi。此後，在許多真核生物中發現了dsRNA介導的RNAi現象，如真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬壁等。，並逐漸證實植物中的轉錄後基因沈默、共抑制、RNA介導的病毒抗性和真菌平息都屬於RNAi在不同物種中的表現。RNAi阻斷基因表達的機制雙鏈RNA進入細胞後，在Dicer酶的作用下，可以分裂成小幹擾RNA (siRNA)。另壹方面，雙鏈RNA可以在RdRP(聚合酶RNA 2di2指導RNA合成，RDRP)的作用下自我擴增，然後通過Dicer酶分裂成SiRNA。雙鏈siRNA變成單鏈，並與壹些蛋白質形成復合物。Argonaute2是唯壹已知的參與復合物形成的蛋白質。壹方面，該復合物與互補於siRNA的mRNA結合，該mRNA被RNase切割；另壹方面，以siRNA為引物，mRNA為模板，在RdRP的作用下合成mRNA的互補鏈。結果mRNA也變成雙鏈RNA，雙鏈RNA也被Dicer酶切割成siRNA。這些新產生的sir2nas也可以誘導RNAi。通過這種聚合酶鏈式反應，細胞內的siRNA大大增加，從而顯著增加了對基因表達的抑制。RNAi可以從21 ~ 23個核苷酸的siRNA誘導成數百個核苷酸的雙鏈RNA，但長雙鏈RNA阻斷基因表達的作用明顯強於短雙鏈RNA。RNAi基因敲除的優勢是1。與同源重組法相比，更簡單，周期大大縮短。2.對於哺乳動物來說，比如對於壹些在基因敲除小鼠胚胎中就會死亡的基因，我們可以利用RNAi技術來研究它們在體外培養的細胞中的功能。3.由於RNAi能夠有效且特異性地阻斷基因表達，因此成為研究信號轉導通路的良好工具。4.RNAi也用於研究在發育過程中起作用的基因。例如，RNAi可用於阻斷某些基因的表達，以研究它們是否在胚胎幹細胞的增殖和分化中起關鍵作用。siRNA的制備方法迄今為止，常用的制備siRNA的方法有五種:化學合成法、體外轉錄法、RNase III(如Dicer、大腸桿菌、RNase III)降解長片段dsRNAs法、siRNA表達載體或病毒載體在細胞中表達SiRNA法、PCR制備siRNA法。
上一篇:去海南留學要帶什麽特產(東西)去老家(浙江)？下一篇:夏季吃什麽美食比較好？