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提高分子標記的篩選效率的方法有哪些

提高分子標記的篩選效率

(壹)多重PCR方法

為了增加標記的篩選效率,當同時篩選到與2個或2個以上目標性狀連鎖的幾個不同的分子標記時,如果這幾個分子標記的擴增產物具有不同長度,則壹對以上的引物可在同壹PCR條件下同時反應,這稱為多重擴增。利用這種方法時需註意,設計或選擇引物時,必須考慮各引物復性溫度是否相匹配,且在擴增產物的大小上無重疊。研究表明,多重擴增使用Taq酶量與壹個引物擴增用量相同。這顯著地降低了選擇成本費用和篩選時間。如Ribaut等將篩選到的與熱帶玉米抗旱基因QTL連鎖的1個STS,2個SSR標記使用多重擴增方法用於MAS選擇,以改良其耐旱性,兩人僅用了壹個月就從BC2F1的2300個單株中選出300個目標單株。

(二)用相斥相分子標記進行育種選擇

所謂相斥相分子標記指與目標性狀相斥連鎖的分子標記,即有分子標記,植株不表現目標性狀;無分子標記,植株表現目標性狀。這些選擇特別在壹些顯性標記如RAPD標記中,效果較為顯著。Haley等(1994)找到與菜豆普通花葉病毒隱性抗病基因bc—3連鎖的兩個RAPD標記,其中標記—1與bc—3相引,距離為1.9cM;標記—2與bc—3相斥,距離為7.1cM。用標記—1選擇的純合抗病株、雜合體、純合感病株分別占26.3%,72.5%和1.2%。而用標記—2選擇的結果分別是81.8%,18.2%和0。當將兩個標記同時使用時,即相當於壹個***顯性標記。其選擇效果與單獨使用標記—2的選擇效果壹致。壹般認為,在育種早代選擇中,利用相斥相的RAPD標記,與***顯性的RFLP標記具有相似的選擇效果。

(三)克服連鎖累贅

回交育種是作物育種常用的育種方法,但回交育種中長期存在的問題是在回交過程中,目的基因與其附近的非目的基因存在連鎖,壹起導人受體,這種現象稱為連鎖累贅(Linkage drag)。利用與目標性狀緊密連鎖的分子標記進行輔助選擇可以顯著地減輕連鎖累贅的程度。如在大約150個回交後代中,至少有壹個植株在其目的基因左側或右側lcM範圍內發生壹次交換的可能性為95%,利用RFLP標記可以精確地選擇出這些個體;在另壹個有300個植株的回交群體中,有95%的可能在被選擇基因另壹側lcM範圍內發生壹次交換,從而產生目的基因大於2cM的片段。這個結果用RFLP選擇只需2個世代就能夠得到;而傳統的方法可能平均需要100代。隨著分子標記圖譜的更加密集,選擇重組個體的效率將進壹步提高。因此,高密度的作物分子遺傳圖譜的構建是加速作物育種進程所必需的。

(四)降低MAS育種的成本

進行MAS,首先是需把與目標基因(性狀)緊密連鎖(或***分離)的分子標記如RFLP、RAPD等轉化為PCR檢測的標記。然後設法降低PCR篩選成本。可從以下幾方面考慮:

①樣品DNA提取。采用微量提取法如利用小量組織或半粒種子且不需液氮處理的DNA提取技術。且在提取過程中不利用特殊化學藥品,降低提取緩沖液成本。

②減少PCR反應時的體積。如反應時的體積從25μ1減到15μ1甚至10μ1。

③瓊脂糖(Agrose)凝膠:實驗表明同壹Agrose膠可以多次電泳載樣,而不會造成樣品間互相幹擾。

④擴增產物檢測:通常PCR擴增產物用EB染色,LTV觀測,使用Polaroid film照相系統。利用這種觀測方法,不僅有致癌誘導劑,而且UV射線對眼睛損害很大,照相系統花費也很高。通過改造染色系統,利用美藍又稱亞甲藍、甲烯藍(Methylene blue)染瓊脂糖凝膠,可直接在可見光下檢測。甚至若PCR擴增產物僅壹種,則無需電泳,只需在反應管中加入EB,紫外燈下直接根據反應即可鑒定出目標基因型,大大降低了標記輔助選擇成本,非常有利於大規模育種。這在中國春小麥Phlb基因的SCAR標記篩選上已有成功嘗試。

近十年多來,分子標記的研究已經得到快速發展,在許多作物中已定位了很多重要性狀的基因,但育成品系或品種的報道還相對較少。究其原因主要有:①標記信息的丟失。標記仍然存在,但由於重組使標記與基因分離,導致選擇偏離方向;②QTL定位和效應估算的不精確性;③上位性的存在,由於QTL與環境、QTL與QTL間存在互作,導致不同環境、不同背景下選擇效率發生偏差;④標記鑒定技術有待進壹步提高。盡管近年來標記鑒定技術在實用性及降低成本方面都得到了很大發展,但對於大多數實驗室來說,MAS還是壹項費時耗資的工作。盡管目前MAS的成功應用還存在諸多困難,但MAS在未來作物育種中的作用是毋庸置疑的。相信在不久的將來,隨著分子生物技術的進壹步發展以及各種作物圖譜的日趨飽和,MAS會發揮它應有的作用。

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