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求助酶活測定方法,謝謝路過的大俠

壹、原則

pH值和溫度

體外測定酶活力時選擇的測定條件應盡可能接近酶在動物體內的消化環境.

幹擾成分

側定酶活力時應盡可能的去除幹擾成分.

底物

在選擇底物時壹定要用純度較高的底物,底物的反應濃度也不應太高.

酶樣的稀釋度

稀釋度要適中,過高,酶活力與產物生成量的關系就會超出線性範圍.

其他因素

酶促反應時間、反應體系的離子強度等因素也可以影 響酶活力的測定結果.因此,在酶活力體外測定時需要對這些 因素進行深人研究.

二、酶活測定方法

還原法

酶與底物在特定的條件下反應,酶可以促使底物釋放出還原性的基團.在此反應體系中添加化學試劑 ,酶促反應的產物可與該化學試劑發生反應,生成有色物質.通過在特定的波長下 比色 ,即可求 出還原產物的含量 ,從而計算出酶活力的大小 .

色原底物法

通過底物與特定的可溶性生色基團物質結合,合成人工底物.該底物與酶發生反應後 ,生色基團可被釋放出來 ,用分光光度法即可測定顏色的深淺,在與已知標準酶所做的曲線比較後 ,即可求出待測酶的活力.

粘度法

該法常用於測定纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力.木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情況下可形成極高的粘度,當酶作用於粘性底物時木聚糖和β-葡聚糖會被切割成較小的分子使其粘度大 為降低.基 於Poiseuille定律我們知道 ,只要測定壹定條件下溶劑和樣品溶液的運動粘度,便可計算特性粘數,並以此來判斷酶的活力.

高壓液相色譜法

酶與其底物在特定的條件下充分反應後 ,在壹定的色譜條件下從反應體系中提取溶液進行色譜分析,認真記錄保留時間和色譜圖,測量各個樣的峰高和半峰高,計算出酶促反應生成物的含量 ,從而換算出酶活力的數值.

免疫學方法

常用 於酶活性分析的免疫學方法包括:免疫電泳法 、免疫凝膠擴散法.這兩種方法都是根據酶與其抗體之間可發生特定的沈澱反應 ,通過待測酶和標準酶的比較,最終確定酶活力.免疫學方法檢側度非常靈敏,可檢側出經過極度稀釋後樣品中的酶蛋白,但其缺點是不同廠家生產的酶產品需要有不同特定的抗體發生反應.

瓊脂凝膠擴散法

將酶作用的底物與瓊脂混合熔融後 ,倒入培養皿中或載波片上制成瓊脂平板.用打孔器在瓊脂平面上打出壹個約4-5mm半徑 的小孔.在點加酶樣並培養24h以後 ,用染色劑顯色或用展開劑展開顯出水解區,利用水解直徑和酶活力關系測定酶活力.

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