與相應的第壹抗體特異性結合，然後與酶或同位素標記的第二抗體結合，最後通過底物顯色或放射自顯影檢測特定目的基因表達的蛋白質組分。
蛋白質樣品制備
原始樣品可以是細胞、組織、培養上清液、免疫沈澱或親和純化的蛋白質。以下為目的蛋白定性檢測的細胞樣品處理方法，其余樣品制備方法參考相關文獻。
1.培養細胞或藥物治療。
2.丟棄培養基，用1X PBS沖洗細胞兩次，以去除殘留的培養基。
3.添加1X SDS樣品緩沖液，刮去細胞並轉移至Ep管。註意:在冰上操作。
4.超聲波切割DNA 10 ~ 15秒，降低樣品粘度。
5.將樣品煮沸5分鐘。
6.離心12000g 5min，取上清液。
SDS-PAGE電泳
首先，清潔玻璃板
第二，膠水和樣品
1.玻璃板對齊後，放入夾具中夾緊。然後垂直貼在架子上準備倒膠。
2.與10%分離膠混合，加入TEMED，並在倒膠前立即搖勻。倒膠時，可用10ml槍吸5ml膠，沿玻璃釋放，直至膠面上升至綠化帶中線高度。然後在膠裏加壹層水，液封後凝膠會更快。
3.當水和膠水之間有折射線時，說明膠水已經凝固。等3分鐘膠水完全凝固後，就可以把膠水上層的水倒掉，用吸水紙吸幹。
4.混合4%的濃縮膠，加入TEMED，立即搖動即可倒膠。用濃縮膠填滿剩余的空間，然後將梳子插入濃縮膠中。當濃縮膠凝固後，雙手握住梳子兩側，輕輕垂直向上拔出。
5.用水沖洗濃縮凝膠，放入電泳槽中。
6.在電泳槽的上下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS電泳緩沖液，上樣。
7.將電泳槽連接到電泳儀器。上槽連接到負電極，下槽連接到正電極。起電電壓70 ~ 80 V，10min後100V，電泳2小時或溴酚藍從底部遷移到1cm時停止電泳。
旋轉膠片
1.將膠水浸泡在轉移緩沖液中，並平衡10分鐘。註意:如果檢測的是小分子蛋白，這壹步可以省略，因為小分子蛋白容易擴散出凝膠。
2.根據膠水的大小，剪下6片膜和濾紙，放入轉移緩沖液中平衡10分鐘。如果使用PVDF膜，需要用純甲醇飽和3-5秒。
3.組裝轉移夾層:海綿3層濾紙膜，3層濾紙海綿。每層放好後，用試管驅趕氣泡。記住:膠水放在反面(黑面)。
4.將轉移槽放入冰浴中，放入三明治(黑色面對黑色)，加入轉移緩沖液，插上電極，100V，1h(電流約為0.3A)。
5.膜轉移完畢後，切斷電源，取出混合膜。
閉合和雜交
1.用25毫升TBS在室溫下沖洗膜5分鐘，並搖動。
2.室溫下，將膜置於25ml封閉緩沖液中65438±0h，並搖動。
3.15mlTBS/T/t共3次(5min/T)。
4.加入適當稀釋的壹抗，在室溫下孵育1-2h或4°C過夜，並緩慢搖動。
5.1.5毫升TBS/t，共3次(5min/T)。
6.加入適當稀釋的堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育65438±0h，緩慢搖勻。
7.1.5毫升TBS/t，共3次(5min/T)。
8.15毫升TBS洗1次。五
著色
將發光液體A和發光液體B按比例稀釋混合。用去離子水將膜稍沖洗幹凈，將濾紙在邊角吸幹，用反貼法蓋在A、B混合液滴上，關燈至可見淡綠色熒光帶(約5分鐘)，再將濾紙在邊角吸幹，放入保鮮膜中固定在膜盒中，迅速蓋上膜，合上塑料盒，根據所見熒光強度曝光。
取出膠片，立即浸入顯影液中1 ~ 2 min。用清水沖洗幹凈，放入定影液中，直到膠片完全固定。用清水沖洗幹凈，晾幹。標記它，分析和掃描它。
WB中常見問題及解決方法。
首先，信號強度低
信號強度低是指正常曝光條件下得到的目標條帶很小或沒有目標條帶，增加曝光時間會導致背景高、雜帶多等問題。掃除試劑質量和操作失誤的影響，產生這類問題的主要原因如下:
①樣品中缺乏蛋白質表達。建議增加高蛋白表達的細胞系作為陽性對照，或適當增加樣本量以獲得更高程度的信號；
②蛋白質降解。蛋白質樣品制備過程中註意蛋白酶抑制劑PMSF的使用，對制備好的樣品盡快檢測或妥善保存；
③蛋白質轉移。對於高分子量蛋白質來說，使用具有合適孔徑的膜並優化膜轉移時間可能需要更長的膜轉移時間。
④抗體的應用。抗體的反應種類和實驗類型能滿足實驗的需要。此外，抗體的稀釋比例和孵育時間也需要在實驗中不時優化。
⑤蛋白質與抗體的分離率低。減少洗膜次數或縮短洗膜時間，降低洗膜液中NaCl的濃度等。
⑥抗原被封閉液覆蓋。改用不同的封閉液，優化封閉液中蛋白質的濃度，縮短封閉時間；
⑦甲醇濃度過高。蛋白質會從SDS中分離出來，沈澱在凝膠中，同時使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白質的轉移。實驗中可以適當降低甲醇的濃度或者用乙醇和異丙醇代替。
第二，非特異性條帶或條帶位置錯誤。
WB結果中靶帶以外的帶稱為非特異性帶，有時非特異性帶很明顯，但沒有靶帶，會對結果的分析產生很大幹擾。壹般來說，導致這些問題的主要因素有:
①抗體的非特異性分離。壹般認為多克隆抗體的特異性不如單克隆抗體，更容易產生非特異性條帶，適當降低抗體濃度有助於減少雜帶。同時，為了排除二抗非特異性分離的可能性，建議設置二抗陰性對照；
②樣品蛋白質含量過高。適當減少上樣量，延長洗滌時間和封閉時間，可以防止高蛋白質含量對實驗結果的不利影響；
③蛋白質降解。會導致條帶位置的改變，產生更多的雜帶，建議采用新制備的或凍融次數少的樣品；
④細胞傳代次數過多。會導致蛋白質表達形式的分化，建議使用原始或傳代較少的細胞系；
⑤蛋白質有復合物。壹些目標蛋白會與其他蛋白分離形成復合物，從而導致條帶位置的改變。需要查閱相關文獻來確認蛋白質是否能形成穩定的復合物。
⑥蛋白質中存在剪接或各種修飾。局部蛋白質中存在剪切位點，部分剪切體具有免疫活性，在WB中也會檢測到。此外，壹些目標蛋白會有糖基化位點或其他修飾位點，條帶大小可能遠遠超過理論分子量。因此，需要查閱文獻或uniprot來了解蛋白質剪切和修飾位點的大小。
第三，背景太高
在局部WB結果中，條帶外本應空白的背景也會出現較暗的顏色，幹擾分析結果，結果圖也不美觀，難以用於文章發表。該問題的可能原因如下:
①封鎖不充分。背景高的壹個主要原因是封鎖有問題。建議使用合適的封閉劑(脫脂奶粉、BSA等。)優化反應濃度和封閉時間，同時註意防止抗體與封閉劑的交叉反應，以及封閉劑與靶抗原、內源性生物素或親和素/鏈黴親和素的配伍禁忌。
②膜清洗不充分。適當增加洗膜次數和放寬緩沖液體積，增加吐溫20的百分比，可以改善洗膜不充分造成的背景高的問題；
③抗體的應用。壹抗濃度高是背景高的原因之壹，二抗可能與封閉劑非特異性分離，建議適當優化壹抗濃度，設置二抗陰性對照。
④曝光時間長。建議在實驗中采用適當的曝光時間。
四、條狀分散或形狀奇怪
有時候，波段在WB結果圖中的位置符合預期，但由於波段分散、形狀奇特等因素無法使用。這種情況多是制膠或電泳過程中出現問題造成的，如下:
①電泳時電壓和電流過高。會導致條帶遷移速度加快，SDS-PAGE溫度升高，並可能導致條帶分散變形。建議使用合適的電泳條件，堅持低溫；
②電極不平衡。會導致試條偏斜，加載時在無樣品的塑料孔中加入等量的樣品緩沖液即可防止；
(3)當樣品量過高時，樣品中的鹽離子濃度高。樣品上樣量過大可能導致譜帶分散，樣品中鹽離子濃度的差異會導致譜帶不均勻等問題。所以要保證樣本量的不同和合適，堅持相同和較低的鹽離子濃度。
④制膠的問題。調膠的時候壹定要攪拌均勻。裝樣前，用針把膠孔拉直，把膠孔裏的氣泡吹出來。
⑤電泳緩沖液存放時間過長。電泳實驗中緩沖液放置時間過長，會對結果產生不良影響，建議及時更換緩沖液。
五、膜上汙漬分布不均
有時候WB做出壹個結果後，除了目標條帶外，還有不規則的汙漬散落在膠片上，也會對結果產生很大的幹擾。出現這種問題的主要原因如下:
(1)試劑、儀器等汙染。建議註意每次實驗前後實驗儀器的清算，及時更換出現問題的試劑；
(2)轉膜時有氣泡。確保在薄膜轉移過程中氣泡被清除幹凈；
③孵育過程中抗體與膜接觸不充分。保證抗體孵育過程中液體總量充足，同時均勻分配抗體，在搖動的情況下停止孵育；
④曝光時間。過度曝光會導致斑點更明顯，建議采用合適的曝光時間；
⑤膜很無聊。實驗中需要保證有足夠的反應液，防止幹膜出現。