案發17天後，聯邦調查局完成了第壹份完整的官方調查報告，並提交給沃倫委員會。聯邦調查局在報告中陳述，案發時，兇手***射出了3顆子彈，第壹顆射中肯尼迪總統的背部，第二顆射中了康納利州長，第三顆子彈直接射中肯尼迪總統的頭部，並致死。這份調查報告還認為這三顆子彈都是奧斯瓦爾德射出。
後來人們發現，聯邦調查局在調查過程中，很大程度上依靠的是特工得到的壹份屍檢報告。這份屍檢報告中顯示，第壹顆子彈只射入肯尼迪總統的背部數英寸深處，並陷入其中，沒有穿出。當聯邦調查局完成調查報告後，他們才收到了官方的正式屍檢報告，這份報告表明，子彈從肯尼迪總統的背部射入，並從他的喉嚨部位穿出。
刺殺肯尼迪的疑兇奧斯瓦爾德被人槍殺後，約翰遜總統親自任命了壹個特別委員會負責徹底調查這壹謀殺案件，這個委員會全部由得克薩斯人組成，美國首席法官厄爾·沃倫是這個委員會的主席。他們的調查結果全部收入了《總統特別委員會關於肯尼迪總統被暗殺的調查報告》中，這個具有51本之多的報告也叫做《沃倫報告》。這份報告後來被封存了起來，要在75年後，即公元2038年，待所有與本案有關聯的人全部死後，才能公諸於世，這使得肯尼迪遇刺壹案變得更加撲朔迷離。
1965年9月25日，經過10個多月的調查，沃倫委員會新聞媒介公布壹份調查報告《沃倫報告》（全文： ），宣稱槍擊肯尼迪是奧斯瓦爾德的個人行為，沒有任何更深的政治背景。結論壹經公布，壹些民間機構宣布要把案件查個水落石出，但這壹案件仍然未有進展。
2008年2月18日，達拉斯縣地方檢察官克雷格·沃特金斯在記者會上出示了12個裝滿魯比行刺壹案檔案和物證的箱子。這些箱子壹直儲存在達拉斯法庭11樓壹間辦公室的保險櫃中。這批重要物證和檔案包括：此案負責人、前達拉斯縣地區檢察官亨利·韋德的私人信件，魯比的壹個手槍皮套和手槍上的指節鋼套，幾張魯比夜總會的會員卡，幾件疑似屬於魯比和奧斯瓦爾德的衣物等。
其中有壹份奧斯瓦爾德和魯比之間的談話記錄抄本。該抄本顯示，肯尼迪遇刺前約2個月，1963年10月4日，奧斯瓦爾德在魯比的夜總會中與後者進行了壹次秘密會談。他們當時討論了刺殺肯尼迪總統的陰謀，希望借此阻止肯尼迪的弟弟、時任司法部長的羅伯特·肯尼迪針對黑手黨的嚴打議程。位於肯尼迪當年遇刺現場附近的“六樓博物館”館長加利·麥克指出：“檔案上早有記載，奧斯瓦爾德（1963年）10月4日晚上呆在得克薩斯州艾溫市，與妻子在壹起。”換句話說，奧斯瓦爾德當晚並未前往達拉斯市會晤魯比。沃特金斯的首席助理摩爾女士則認為，這些談話抄本可能是前檢察官亨利·韋德撰寫的壹部電影腳本，因為在檔案中發現了壹份韋德和電影制片人合作時簽訂的合約。不過，該電影從未被制作完成。聯邦調查局（FBI）對這份談話抄本進行鑒定，結論是偽造。 沃倫委員會認為，奧斯瓦爾德系獨自作案，不存在其他任何同謀；傑克·魯比也是獨自作案，槍殺了奧斯瓦爾德。沃倫委員會報告和聯邦調查局的調查結果，都壹致地認為刺殺現場只射出了三顆子彈。但沃倫委員會認為這三顆子彈中，壹顆子彈射偏，壹顆子彈從肯尼迪的背部射入，並從喉嚨射出，繼而射中康納利州長，致命的第三顆子彈直接擊中肯尼迪總統頭部。
爭論由此產生，很多人質疑刺殺現場射擊的子彈的數量。因為如果接受沃倫委員會的調查結論，就意味著壹顆長3厘米、直徑6.5毫米的步槍子彈，在從德克薩斯州教科書倉庫大廈6層窗口射出後，先是穿透肯尼迪總統的脖頸，然後再射穿康納利州長的胸部和手腕，最後射入州長的大腿裏，***造成7處傷口。它穿過了15層衣物、7層皮膚、38厘米厚的人體器官，以及總統的上衣領結和4英寸肋骨的阻礙，並徹底擊碎了康納利州長的橈骨，最終射入他的左腿。在帕克蘭醫院承載州長的擔架上，這顆子彈被發現，而且外殼完整，只是在尾部有壹點點變形。沃倫委員會嘗試對這顆子彈的運行軌跡進行解釋，並逐步衍生出廣為人知的“壹顆子彈”理論（Single-bullet Theory）。
該理論最有力的證據來自達拉斯市民澤普魯德的錄像，這是現在唯壹可以得到的記錄整個刺殺過程的最完整錄像。從錄像中可以看出，肯尼迪總統第壹次中槍是在第210幀和225幀之間，而康納利州長在第240幀之前被射傷，之間最長間隔不超過30幀。聯邦調查局的射手們，通過模擬實驗，發現犯罪嫌疑人奧斯瓦爾德所使用的曼利舍·卡爾卡諾M91/38栓動步槍“在精準定位情況下，連發兩顆子彈之間的最短時間間隔大約為2.25秒”。根據聯邦調查局的測算，澤普魯德這段錄像中每秒的時間折合為18.3幀，2.25秒也就是41幀至42幀。因此，奧斯瓦爾德不可能在30幀連發兩顆子彈。
通過對傷口的研究，沃倫委員會也試圖從理論上證明壹顆子彈造成7處傷口的可能性。他們假設子彈從教科書倉庫大廈的6層射出58米後，以與水平線呈19°的角度擊穿肯尼迪的第六塊頸椎骨。在肯尼迪總統脊柱右下方51毫米處，子彈留下了壹個4×7毫米的傷口，傷口四周是棕紅色和黑色的血瘀痕，也就是通常所說的“擦拭輪”。根據屍檢報告，子彈在總統體內造成第壹節胸椎的損傷，但是由子彈擊中所致，還是由於子彈的沖擊力造成還無定論。子彈從肯尼迪右肺葉上方擦過，沒有造成穿透。緊接著子彈穿過總統的脖子，從喉結下方射出。總統襯衫衣領上的痕跡，證明了子彈是從後背射入，而不是從喉嚨射入。在整個過程中，子彈的速度從射出時的560-610m/s（即米每秒），降到了518m/s。值得壹提的是，肯尼迪總統當時還佩戴了領結，子彈打掉領結後，速度迅速降為457m/s，方向也發生偏離。
子彈很快穿越了肯尼迪總統和康納利州長之間64.77厘米的距離，並從州長右側腋下射入，留下壹個8×15毫米的橢圓形傷口。傷口的形狀充分表明，子彈是以很小的角度斜向劃入。在州長胸腔內，子彈碎裂，徹底破壞了他的第五條肋骨，事後遺留在州長體內的大量金屬殘片也佐證了這壹點。子彈的主體從州長右乳頭下方飛出，留下壹條50毫米的傷口。隨後子彈射穿康納利州長的襯衫和外套，出口恰好是在外套右側翻領的最下方。很快，子彈以274m/s的速度再次進入康納利的體內。這次是從外側射入他的右手腕，並擊碎了他的右手橈骨。子彈從康納利州長手心方向射出，此時，子彈的速度已經降至122m/s。子彈沒有停止，繼而射入了州長左大腿前端，留下壹條將近10毫米的外傷，並最終留在州長康納利左腿的肌肉裏。
對於這種解釋，沃倫委員會表示，他們“從專家那裏獲得了有力的證據”。但他們也坦言，委員會內部“對這種可能性”存在“不同意見”，這種理論並不足以得出明確的結論。根據常識判斷，按照正常的坐姿，肯尼迪總統和康納利州長身上的7處傷口並非是在壹條直線上。難道這顆神奇的子彈，不僅具有如此強大的穿透力，還可以在空中變換方向？所以“壹發子彈”理論也被稱為“魔術子彈”理論。
沃倫委員會的調查報告疑點重重，羅伯特·肯尼迪曾在私下裏表示沃倫報告“做工低劣”。最被詬病的是報告中的目擊者證詞，絕大多數證詞都是在委員會成員未過半的情況下作出的，全部94份證詞只有壹個是在委員會全體在場的情況下作出，但這些證詞最終都被委員會采信。
包括壹些目擊者在內的人，聲稱案發現場至少有4顆子彈被射出。只有這樣，才能更完美地解釋這7處傷口的來源。聯邦調查局的試驗已經證明，嫌疑人奧斯瓦爾德不可能在這麽短的時間內連發4彈，如果這些證人所說的屬實，那就意味壹個可怕的結局——還有壹個兇手在逍遙法外，並且刺殺並不是奧斯瓦爾德個人行為，而是團夥作案、分工合作、交叉射擊——壹場事先謀劃好的陰謀。
還有壹種理論也試圖證明第二名槍手的存在，從澤普魯德的影片中能看到，肯尼迪被最後壹發子彈擊中頭部以後，身體明顯地向左後方仰倒。許多人據此認為，這顆致命的子彈從他右前方的草坡飛來，而不是從他後上方的教科書倉庫大樓射出。不過創傷彈道專家得出的結論是大腦受創的時刻，神經反射會使背部肌肉收縮，因此不影響子彈從後方射來的結論。
“水門事件”爆發後，參議院的特別委員會（史稱“徹奇委員會”）對政府的情報活動展開了大規模的調查。徹奇委員會發現，中央情報局和聯邦調查局在肯尼迪遇刺案的調查上存在著重大缺陷，而與此案有緊密關聯的證據並沒有被提交給沃倫委員會；更為重要的發現是，聯邦調查局在調查時，曾被胡佛幹涉，也收到了來自“不知名的政府要員”的壓力，因此不得不草草結束調查。徹奇委員會的調查在美國人中驚起了壹陣波瀾，這意味著，很有可能中央情報局和聯邦調查局在肯尼迪遇刺案中達成壹致，封鎖了部分重要信息。
面對著公眾的不斷質疑，到1976年，國會成立關於約翰·肯尼迪和馬丁·路德·金遇刺的特別調查委員會（HSCA）。在肯尼迪事件上，HSCA於1979年公布了調查報告。報告認為，奧斯瓦爾德為刺殺總統的兇手，他***射擊了三顆子彈，第二和第三發命中總統，第三發殺死了總統；但聲學研究表明，案發現場至少有兩名兇手的可能性非常大；肯尼迪總統很有可能是死於壹場陰謀，但陰謀的內容，HSCA無法確定；美國司法部、中央情報局、聯邦調查局和沃倫委員會都曾企圖掩蓋壹些信息；HSCA認同“壹顆子彈”理論。HSCA對美國特勤局的行動也挑出了不少毛病，比如肯尼迪在達拉斯沒有得到足夠的保護；特勤局收集到的信息沒有被充分分析、調查和使用；高速公路上也沒有做好足夠的準備去保護肯尼迪以防刺客。
對刺殺現場射擊的次數，HSCA對現場178名目擊證人進行了調查。HSCA發現，目擊者對於子彈數量的記憶確實說法不壹。但其中132人聲稱聽到3聲槍響，當然，也有個別的認為聽到了2聲、4聲或更多。
HSCA後來又提出壹種可能：在案發現場，***射擊了四顆子彈；新增的這顆子彈來源於隱藏在迪利廣場草坡上的槍手。這個推測的證據來源於壹部電話錄音帶，這個錄音當時在案發現場附近，被攜帶在壹位騎著摩托車的警官身上。不過，這顆子彈射失了，盡管沒有給肯尼迪和康納利帶來傷害，但存在第二名槍手的可能性並沒有被封死。
HSCA利用聲學手段，對比錄音帶中的波峰，進而對現場的槍聲進行了判別。他們認為，錄音帶中的第1、2、4次波峰正是從倉庫大樓射出的槍聲。而第3次波峰，有壹半的可能性是發自草坪上的槍聲。隨後，兩名來自皇後學院的聲學分析家通過對錄音帶BBN數據的分析，認為“他們對草坪上發出的槍聲有95%以上把握”。當然，反對意見很快也隨之而來，有人說第3次波峰其實是摩托的馬達聲或汽笛聲，甚至有人就此發表了壹系列相關的學術論文。整個案件顯得愈發撲朔迷離。
在《信息自由法案》和《肯尼迪檔案法案》推動下，1992年，98%的沃倫委員會檔案都已開放。剩余的肯尼迪遇剌案相關檔案將於2017年開放。但不包括肯尼迪的屍檢照片和X光照片，它們是由肯尼迪家族附加了限制條件於1966年捐給海軍檔案庫的。有少數幾件證物失落或被毀了，如轎車在11月24日被清洗了，奧斯瓦爾德的服役檔案在1973年被毀了，康納利的衣服洗了，帽子和手鏈不見了。
然而，民間對於肯尼迪遇刺案的探索從未停止。探索頻道的特別節目《未解的歷史：刺殺肯尼迪——不可思議的子彈之外另有懸疑》試圖盡可能再現事件發生時的情景。組織者在實驗中使用了彈道學研究用人體明膠，其中嵌入了壹組類似人類骨骼的物質材料。研究顯示，如果子彈在擊穿骨骼之前，經由類棉紗質地的物質，得到了壹段距離的緩沖，那麽還是有可能大體維持形態不變的。
接下來，實驗者精確仿照事發現場肯尼迪和康納利兩人的相對位置，放置了兩個用於彈道試驗及解剖學研究的材料制成的人體模特，它們是用獸皮、明膠以及內置的類骨骼質地註模做成的。壹名射術精良的槍手使用與在書庫找到的那款槍型號相同的步槍，在等距於書庫大樓6層位置的地方射擊。彈匣裏的彈藥是1963年時西部彈藥公司（Western Cartridge Company）為卡爾卡諾步槍裝備的同壹批次6.5x52mm子彈。在高速攝影的追蹤下，那顆出膛的子彈幾乎完全復制了事件現場受害者負傷時子彈的軌跡。唯壹的差別在於，實驗中，子彈動能不足，未能穿透康納利的人體模型代表其大腿的那個部分。之所以如此，是因為子彈在實驗中額外擊中了模型的另壹根“肋骨”，也就是說，模型被擊碎了兩根肋骨，而康納利只有壹根肋骨受傷。此外，子彈的變形程度也略甚於CE 399號證物子彈，這恐怕還是擊碎“兩根肋骨”所致。問題是，僅僅壹槍，而且子彈大體維持原狀，就制造出了與刺殺現場兩名受害者所有傷處相同的結果。
1993年，壹個名叫戴爾·梅爾斯（Dale Myers）的電腦動畫師啟動了壹個為期10年的計劃，試圖以3D電腦動畫形式完整呈現11月22日肯尼迪遇襲現場。他的成果展現在美國廣播公司（ABC）2003年的紀錄片《肯尼迪刺殺案揭秘》（The Kennedy Assassination: Beyond Conspiracy）之中，並贏得了艾美獎。
為了制作動畫，梅爾斯通過拍攝照片、搜集影像等手段進行采樣，並繪制了動畫設計藍圖，以期精準重現慘案現場。壹個評估機構指出，梅爾斯的作品之於人們再睹暗殺事件的來龍去脈而言，達到了以“全方位的視野，實現歷史時空重置的幾何完整性”的高度；可以確信，其作品“在完備與細致程度上已然超越了對歷史做出公正而準確的描述的要求”。
在這部紀錄片中，梅爾斯對澤普魯德的錄像進行了局部檢視，證實了關於那唯壹壹顆子彈的理論。他特別留意到錄像中有壹處鮮少有人察覺的異常現象。在迪利廣場（Dealey Plaza），當肯尼迪的座駕從街牌背後駛出時，那壹瞬間——也就是澤普魯德錄像的223與224幀所示——康納利州長外套的右襟看上去似乎是被壹股不知來自何方的力量“突然掀了起來”。據梅爾斯判斷，正是那壹刻，肯尼迪與康納利兩人同時被奧斯瓦爾德那支步槍打出的那壹顆子彈射中了。他還指出，澤普魯德錄像的225至230幀顯示，肯尼迪的身影從街牌背後閃出時，他與康納利同時表現出被子彈擊中的痛苦反應。
2013年7月，美國壹家電視臺根據壹名警察對案件的分析和相關書籍，制作了壹部融合了記錄與戲劇元素的影片。片中暗示，奪走肯尼迪性命的子彈中，有壹顆可能是由是特工發射。據澳大利亞壹名已經退休的警察麥克?勞倫的研究和美國作家梅寧格的相關書籍，美國ReelzChannel電視臺制作了壹部紀錄片，片中暗示，導致肯尼迪喪命的子彈實際上可能來自中情局特工喬治。澳大利亞警察馬克花了四年的時間分析、調查證據。他認為，肯尼迪有可能是死於意外。他說，當時，疑兇奧斯華開了第壹槍，坐在後面壹輛車的中情局特工喬治用配給的槍支還擊，因為對武器不熟悉，加上車子顛簸子彈射偏，打中肯尼迪。 圍繞這壹案件，美國輿論提出了各種假設。有人認為，這是壹起美國中情局和軍界中“鷹派”***同策劃的政變陰謀；另壹些人認為暗殺行動是“黑手黨”所為。還有人將肯尼迪的死與瑪麗蓮·夢露的自殺攪到了壹起。
2013年美聯社公布的壹份民調結果顯示，僅有24%的美國人認為當局捕獲的槍手李·哈維·奧斯瓦爾德是獨自作案，與此形成強烈對比的是，超過半數的美國人相信制造肯尼迪遇刺案的“不是壹人、而是多人”。輿論產生了許多關於此案的陰謀論猜想。有“黑幫說”、“中情局說”、“胡佛說”等多種陰謀論。
約翰遜謀殺說
曾經擔任尼克松秘書和私人助手的羅·斯通披露前總統理查德·尼克松的觀點，尼克松對斯通和其他秘書多次說過，他確信謀殺肯尼迪的幕後主使正是在肯尼迪遇刺後宣誓就任總統的林登·約翰遜。甚至有壹次，尼克松告訴斯通，“我和林登·約翰遜的區別是，雖然我們兩人都想當總統，但我並沒有為此殺人。”
2003年，法國壹家電視臺的兩個記者威廉·雷蒙和貝爾納·尼古拉在經過長達三年的調查後認定：刺殺肯尼迪總統的幕後指使正是當時的副總統林登·約翰遜。電視臺還播出了他們制作的紀錄片。
據這個紀錄片中敘述，1960年總統大選時，肯尼迪與約翰遜曾為誰能代表民主黨競選總統爭得不可開交，由此播下不和的種子。肯尼迪成為美國總統後，約翰遜雖然當了他的副手，卻始終生活在壓力之下。約翰遜出生於得克薩斯州，當地石油大亨源源不斷充實他的秘密金庫。這些錢壹部分用來揮霍，更多則用做賄賂。司法部長羅伯特·肯尼迪早就對約翰遜進行調查，壹些涉及得克薩斯石油大亨的貪汙大案，已經隱約露出約翰遜的身影。另外，肯尼迪決定進行財政改革，向國會提交議案準備大幅削減得克薩斯石油大亨在稅收上享受的優待。該議案如果獲得通過，將使這些石油巨頭失去上億美元的利潤，也將影響到約翰遜的秘密金庫。1963年年底，快被肯尼迪兄弟逼到絕路的約翰遜不惜鋌而走險，借助與聯邦調查局局長胡佛的密切關系，壹手策劃了震驚世界的刺殺肯尼迪事件。
2013年11月美國媒體曝光了當時軍方與白宮通訊錄音——“請給我有關總統的所有信息。這是情況分析室，我從美聯社的公報看到，肯尼迪總統很明顯是頭部中彈，他臉朝下倒在車後排的座位上，頭上有血，肯尼迪夫人壹邊哭喊著‘哦，不’，壹邊扶著他的頭。”
在軍方的通話中，對壹些重要人物使用了代碼，例如下面的這段通話中所說的誌願者是指肯尼迪遇刺後，隨即在空軍壹號上宣誓就任總統的林登·約翰遜——“我們在等待飛機起飛前的宣誓就職。”
“是誌願者嗎？”
“是的，長官。”
卡斯特羅謀殺說
美國中情局壹名退休人員在其壹本關於肯尼迪遇刺案的書中披露，古巴前領導人菲德爾·卡斯特羅當時對肯尼迪的暗殺事先是知情的。他指出自暗殺發生以來關於卡斯特羅可能涉及當時刺殺案的傳言從未中斷過，因為肯尼迪是其強硬的反對者。布賴恩·拉特爾是20世紀60年代是中情局古巴分析人員，還曾是CIA駐拉美情報總監，他在新書中指出，他確信卡斯特羅至少事先知道將會發生刺殺事件。其信息來自對前古巴情報官員的采訪，有美國機密文件作為支撐。但他表示，他沒有證據顯示是卡斯特羅命令了此次刺殺或者奧斯瓦爾德是受卡斯特羅控制。拉特爾同時表示，卡斯特羅是希望肯尼迪死的，因為他害怕肯尼迪，“在他的意識裏，他可能只是自我防衛。”
卡斯特羅曾否認涉肯尼迪遇刺案。
JIM MARR所作的文章稱""肯尼迪被刺殺後短短三年中，18名關鍵證人相繼死亡。其中6人被槍殺，3人死於車禍，2人自殺，1人被割喉，1人被擰斷了脖子，5人“自然”死亡，這種巧合的概率為10萬萬億分之壹。從1963年到1993年，115名相關證人在各種離奇的事件中“自殺”或被殺。"然而經查證所有死亡者中,有的與暗殺或總統的關系相當遠,如它包括了新奧爾良市長,空軍壹號的勤務員和肯尼迪的情婦(全都對暗殺經過毫不知情),而當眾議院調查委員會去信給倫敦周日時報詢問如何得出10萬萬億的機率時,編輯部回答說是搞錯了,他們錯以為計算的是參加了沃倫調查委員會的人員在三年內死亡18人的可能性.