2.勻漿緩沖液:1.0m tris-HCl(pH 6.8)1.0ml；10% SDS 6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O 2.8ml毫升.
3.轉移膜緩沖液:甘氨酸2.9g；Tris 5.8gSDS 0.37g200ml甲醇；加入ddH2O，定容至1000ml。
4 . 0 . 01M PBS(ph 7.4):NaCl 8.0g；KCl 0.2g；na 2 hpo 4 1.44g；KH2PO4 0.24g加入ddH2O至1000毫升。
5.膜染色液:考馬斯亮藍0.2g；80ml甲醇；2ml乙酸；ddH2O118毫升.包衣液(5%脫脂奶粉，現配):脫脂奶粉1.0g溶於20ml 0.01M PBS中。
6.顯色液:DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳銨0.1毫升；；H202 1.0微升.1.單層貼壁細胞總蛋白的提取:
(1)倒出培養液，將瓶子倒置在吸水紙上，使吸水紙吸起培養液(或者將瓶子直立壹會兒，使殘留的培養液流到瓶底，再用移液管吸走)。
(2)向每瓶細胞中加入3ml 4℃預冷的PBS (0.01m pH 7.2 ~ 7.3)。輕輕搖勻細胞1分鐘，清洗細胞，然後丟棄洗液。重復上述操作兩次，* * *洗細胞三次，洗掉培養基。丟棄PBS並將培養瓶置於冰上。
(3)按1ml加入10 μl PMSF(100mM)到裂解液中，搖勻，置於冰上。(PMSF只能在搖動至無結晶時與裂解液混合。)
(4)向每瓶細胞中加入400 μl含PMSF的裂解液，在冰上裂解30分鐘。為了充分溶解細胞，應經常來回搖動培養瓶。
(5)裂解結束後，用幹凈的刮刀(快速移動)刮去培養瓶壹側的細胞，然後用槍將細胞碎片和裂解液移入1.5ml離心管中。(整個操作盡量在冰上進行。)
(6)在4℃下以65分鐘438+02000轉/分鐘離心5分鐘。(提前啟動離心機預冷)
(7)將離心後的上清液分裝，轉移至0.5ml離心管中，保存於-20℃。
2.從組織中提取總蛋白:
(1)將少量組織塊放入1 ~ 2ml勻漿器的球形部分，用幹凈的剪刀盡可能地剪下組織塊。
(2)將400 μL單壹去汙劑裂解液(含PMSF)加入勻漿器中勻漿。然後把它放在冰上。
(3)幾分鐘後，磨壹會兒再放在冰上。重復研磨幾次，盡可能地壓碎組織。
(4)裂解30 min後，用移液管將裂解液轉移至1.5ml離心管中，然後在4℃下以12000rpm離心5min，將上清液分裝於0.5ml離心管中，並保存於-20℃。
3.從用藥物處理的貼壁細胞中提取總蛋白:
由於藥物的影響，壹些細胞脫落，所以除了根據(1)的操作之外，還應該收集培養液中的細胞。以下是從培養基中提取細胞總蛋白:
(1)將培養液倒入15ml離心管中，以2500rpm離心5分鐘。
(2)棄去上清液，加入4ml PBS，用槍輕輕吹洗，然後以2500rpm離心5分鐘。棄去上清液後，再次用PBS洗滌。
(3)用槍洗滌上清液後，加入100 μL裂解液(含PMSF)進行冰裂解30分鐘，裂解過程中頻繁彈跳，使細胞充分裂解。
(4)將裂解物與培養瓶中的裂解物混合，在4℃和12000rpm離心5分鐘，然後取上清液分裝於0.5ml離心管中，保存於-20℃。1.制作標準曲線
(1)從-20℃取出1mg/ml BSA，室溫融化備用。
(2)取1.5ml的18離心管，分別標註為0mg、2.5mg、5.0mg、10.0mg、20.0mg、40.0mg。
(3)根據下表在每個試管中添加各種試劑。0毫克2.5毫克5.0毫克10.0毫克20.0毫克40.0毫克1毫克/毫升牛血清白蛋白-2.5毫升5.0毫升10.0毫升20.0毫升40.0毫升0.15摩爾/升氯化鈉100毫升97.5毫升95.0毫升90.0毫升80.0毫升60.0毫升G250生物分光光度計(Eppentoff)上的比色分析。
2.檢測樣品的蛋白質含量
(1)取足夠的1.5ml離心管，每管加入1ml 4℃保存的考馬斯亮藍溶液。室溫靜置30分鐘後，可用於蛋白質測定。
(2)取壹管考馬斯亮藍，加入0.15mol/L NaCl溶液100 ml，混勻，靜置2分鐘，作為空白樣品。將空白倒入比色杯中，並根據標準曲線程序測量空白樣品。
(3)丟棄空白樣品，用無水乙醇洗滌比色皿兩次(每次0.5mL)，然後再次用無菌水洗滌。
(4)取壹管考馬斯亮藍，加入95ml 0.15mol/L NaCl的NaCl溶液和5ml待測蛋白樣品，混勻後靜置2min，倒入按鈕幹燥的比色杯中，按下樣品鍵，測試樣品。
註意:對於每個樣品，比色皿應該用無水乙醇清洗兩次，用無菌水清洗壹次。多個樣品可以同時混合，然後壹起測量，可以節省大量蛋白質樣品測量的大量時間。測得的結果是5ml樣品的蛋白質含量。
SDS-PAGE電泳
1.清潔玻璃板:
壹只手扣緊玻璃板，另壹只手蘸洗衣粉輕輕擦洗。用自來水沖洗兩面，然後用蒸餾水沖洗幹凈，放在籃子裏晾幹。
2.倒膠和裝樣
(1)玻璃板對齊後，放入夾具夾緊。然後垂直貼在架子上準備倒膠。(操作時，將兩塊玻璃對齊，以免漏膠。)
(2)按照前面的方法混合10%分離膠，加入TEMED後立即搖勻即可倒膠。倒膠時，可用10ml槍吸5ml膠，沿玻璃釋放，直至膠面上升至綠化帶中線高度。然後在膠裏加壹層水，液封後凝膠會更快。(倒膠時可以開始快壹點，膠面達到要求的高度時慢壹點。操作時膠水壹定要順著玻璃板往下流，這樣膠水裏就不會有氣泡了。慢慢加水封口，不然膠水會變形。)
(3)當水和膠水之間有折射線時，說明膠水已經凝固。等3分鐘膠水完全凝固後，就可以把膠水上層的水倒掉，用吸水紙吸幹。
(4)按上法混合4%的濃膠，加入TEMED，立即搖勻倒膠。用濃縮膠填滿剩余的空間，然後將梳子插入濃縮膠中。倒膠時，膠也要順著玻璃板往下流，避免膠內出現氣泡。插入時保持梳子水平。因為膠凝固時體積會收縮減小，加樣孔的裝樣體積會減小，所以在濃膠凝固過程中需要經常補充兩側的膠。當濃縮膠凝固後，雙手握住梳子兩側，輕輕垂直向上拔出。
(5)用水沖洗濃縮凝膠，放入電泳槽中。(小玻璃板朝內，大玻璃板朝外。如果只有壹片塑料運行，凹槽的另壹側應墊上塑料板，字側朝外。)
(6)測定蛋白質含量後，計算含50 ng蛋白質的溶液體積，即為上樣量。取出上樣樣品於0.5ml離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至最終濃度為1×。(壹般上樣總體積不超過15 μl，上樣孔最大可為20μ l..)在裝載前，將樣品在沸水中煮沸5分鐘，以使蛋白質變性。
(7)加足電泳液後，開始準備上樣。(電泳液至少應溢出內部測試的小玻璃板。)用微量取樣器將樣品吸在墻上，吸出樣品時不要吸入氣泡。將取樣器的針頭插入取樣孔，並慢慢加入樣品。(如果加樣太快，樣品會被沖出孔外，如果有氣泡，樣品可能會溢出。添加下壹個樣本時，取樣器應在外槽的電泳緩沖液中清洗3次，以避免交叉汙染。
3.電泳
電泳時間壹般為4 ~ 5 h，電壓為40V，也可用60V。可以停止電泳，直到溴酚藍剛好用完，可以進行膜轉移。1.轉壹張膜需要6張7.0 ~ 8.3 cm的濾紙和1張7.3 ~ 8.6 cm的NC膜或PVDF膜。切濾紙和膜的時候壹定要戴手套，因為手上的蛋白質會汙染膜。切割後的NC膜或PVDF膜必須在水中浸泡2小時後才能使用。(用鑷子夾住膜的壹邊，輕輕放入裝有超純水的平皿中。要使膜浮在水面上，只有下層與水接觸。使得整個膜可以由於毛細作用而被潤濕。如果薄膜沈入水中，薄膜與水之間會形成壹層空氣膜，阻止薄膜吸水。(2)將轉印膜夾、兩塊海綿墊、壹根玻璃棒、濾紙和浸濕的膜放入盛有轉印膜液的搪瓷盤中。
2.打開夾子，使黑色壹側保持水平。放壹個海綿墊在上面，用玻璃棒來回滾動幾次，把裏面的氣泡滾走。壹只手壓住墊子，另壹只手壓住墊子，讓它不能隨便動。在墊子上放三層濾紙(可以先在墊子上疊三張紙)，壹只手固定濾紙，另壹只手用玻璃棒滾出氣泡。
3.在剝膠之前，應該先把玻璃板撬開。撬的時候動作要輕，兩邊要輕輕反復撬。過了壹會兒，玻璃板開始松動，直到被撬開。撬的時候要小心，玻璃板容易裂。)取下小玻璃板後，輕輕刮掉濃縮膠(濃縮膠影響操作)，避免刮傷隔離膠。小心剝掉濾紙上的離型膠皮，用手調整使其與濾紙對齊，用玻璃棒輕輕將氣泡滾出。把膜蓋在膠上，把整個膠蓋好(蓋了膜就不能動了)，去掉氣泡。用3張濾紙覆蓋薄膜，去除氣泡。最後蓋上另壹個海綿墊，滾動幾下合上夾子。整個操作都是在轉移液中進行的，要不斷地去除氣泡。膜兩側的濾紙不能相互接觸，接觸後會發生短路。(轉移液中含有甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門讓空氣流通。)
4.將夾子放入傳輸槽，使夾子的黑色面朝插槽的黑色面，白色面朝插槽的紅色面。電轉移會產生熱量。在罐的壹側放壹塊冰，或者將轉移罐埋在冰水混合物中冷卻。壹般用80V轉1h，或者60V轉2 h，或者40V轉3 h。
5.轉移後，用1×李春洪染料溶液對膜染色5min(在脫色搖床上搖動)。然後用水沖洗掉未染色的染料溶液，就可以看到膜上的蛋白質了。將膠片晾幹備用。1.將膜自下而上用TBS浸泡後，移至盛有密封液的平皿中，在脫色搖床上室溫搖勻密封65438±0h。
2.用TBST將壹抗稀釋至適當濃度(在1.5毫升離心管中)；撕下壹張大小合適的保鮮膜鋪在實驗臺上，用水浸泡四角，保持保鮮膜平整；將抗體溶液加入塑料包裝中；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘液，將膜蛋白面朝下放在抗體液面上，傾斜膜的四個角，驅除殘留氣泡；室溫孵育65438±0 ~ 2小時後，用TBST室溫洗滌兩次，每次65438±00分鐘。用TBS再次清洗10分鐘。
3.用同樣的方法制備二抗稀釋液並與膜接觸，重復步驟(2)的最後壹步進行化學發光反應。1.將試劑A和試劑B在保鮮膜上等體積混合；65438±0分鐘後，膜蛋白與該混合溶液充分接觸，面朝下；1分鐘後，將薄膜移至另壹個保鮮膜中，除去殘留液體，包好，放入x光夾中。
2.在暗室中，將1×顯影劑和定影液分別放入塑料托盤中；在紅光下取出x光片，用切紙刀剪成合適的尺寸(比膠片長寬大1cm)；打開x光夾，把x光放在膠片上，壹旦放上就不能動了，合上x光夾，開始計時；根據信號的強弱適當調整曝光時間，壹般為1分鐘或5分鐘。也可以選擇不同的時間進行多次壓片，以達到最佳效果。曝光完成後，打開x光片架，取出x光片，迅速浸入顯影液中顯影，出現明顯條帶後立即停止顯影。展開時間壹般為1 ~ 2 min (20 ~ 25℃)，溫度過低(16℃以下)時應適當延長展開時間。顯影後立即將x光片浸入定影液中，定影液時間壹般為5 ~ 10 min，直至膠片透明；用自來水沖洗殘留的定影液，在室溫下晾幹。
需要註意的是，沖洗定影液時，盡量取膠片壹角，不要用手指甲刮膠片，否則會影響效果。對膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的分子量和凈光密度。