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獸醫體外診斷的發展趨勢——分子診斷

寵物已經成為現代人重要的家庭成員,圍繞著它們的消費、生老病死,已經形成了壹個上千億的“經濟”產業鏈。其中,需求剛性、消費支出高的寵物醫療占據了產業鏈中的核心位置,成為寵物消費中的“大頭”。

寵物醫療服務,包括寵物的疾病診斷和日常保健服務,是寵物行業僅次於寵物食品的第二大子行業。根據疾病種類,寵物醫療服務包括寵物外科疾病、內科疾病、皮膚病、傳染病和寵物免疫。傳染病是由壹些致病微生物引起的,如細菌和病毒,它們可以在壹些動物或多種動物之間傳播。養好寵物的關鍵是疾病的防治,尤其是壹些傳染性疾病,發病急,傳播快,對動物的健康威脅很大。

隨著人們生活質量的逐漸提高,狗和貓在人們的生活中扮演著越來越重要的角色。而且隨著主人觀念和寵物醫療質量的逐年提高,動物疾病診斷的準確率也從以前的“盲人摸象”逐漸走向了分子診斷的層面。

目前,分子診斷技術已廣泛應用於感染性疾病(包括細菌感染、病毒感染、寄生蟲、真菌、人和動物疾病等)。),腫瘤等領域,因其具有靈敏度高、特異性強、簡便快速、可定性定量檢測等優點。分子診斷檢驗結果對臨床醫療決策的貢獻進壹步增強,檢驗結果的重要性達到了前所未有的高度。

在寵物傳染病檢測技術方面,分子診斷核酸檢測法也具有較高的靈敏度和特異性,可以最大程度地縮短傳染病檢測的窗口期。這種方法也是臨床診斷人類感染性疾病的黃金方法。

其中,PCR是最常用的分子診斷方法。PCR技術利用壹對寡核苷酸作為引物,通過變性-退火-延伸的循環來擴增目的DNA,具有高靈敏度和高特異性的優點。

實時熒光定量PCR實現了從定性到定量PCR的質的飛躍。實時熒光定量PCR技術(在PCR反應體系中加入熒光基團,借助熒光信號實時監測整個PCR過程)不僅具有傳統PCR的優點,還具有特異性強、靈敏度高、重復性好、反應速度快、定量準確、自動化程度高等特點,已成為國際公認的核酸分子定量的標準方法。

實時熒光定量PCR可以早期準確診斷寵物疾病。

在目前的寵物臨床工作中,普遍存在壹個問題,就是很難或無法準確診斷某些病原體。具體表現在以下幾個方面:

1,現有診斷技術靈敏度低。

如:病毒診斷常用的膠體金試紙。雖然膠體金試紙可以提供快速診斷,但這種方法是從蛋白質水平檢測病原體,存在壹定的交叉反應和動物自身抗體的幹擾,導致臨床應用中出現假陽性和假陰性結果;

2.疾病的早期診斷(如潛伏期)和對抗原要求高的疾病。

例如,使用傳統的診斷技術(膠體金試紙和ELISA檢測方法)不能提供準確的診斷依據。如犬瘟熱、細小病毒;

3.臨床上有很多病原體沒有商業化,也不方便商業化生產試劑。

目前,這部分病原體(如貓傳染性腹膜炎)的診斷還不能在獸醫臨床工作的醫院中作出。如果需要做血塗片和大便檢查,會導致主觀性強,容易漏診;

4、在疾病預防和控制過程中。

例如,疫苗接種是預防犬貓病毒性疾病的主要措施,但很難區分血清學檢測的抗體是疫苗免疫產生的還是病毒感染產生的,而PCR可以準確檢測病原體;

5.仍有壹些病例很難診斷出微量的病原體。

細小巴貝斯蟲等疾病。

因此,PCR(尤其是實時熒光定量PCR)使這些疾病的準確診斷成為現實。

根據農業部發布的2013全國動物疫病監測和流行病學調查計劃的要求,結合我國現行的寵物疫病診斷國家標準,頒布了《犬細小病毒診斷技術》(GB/T27533-2011)和《犬瘟熱診斷技術》(GB/T 27532-2065432)。

選擇合適的PCR產物對於pet診斷尤為重要。

在臨床工作中,可供獸醫選擇的PCR有很多,包括無核酸提取、等溫擴增、液體試劑和凍幹試劑、自動PCR等,讓獸醫無從選擇。如何客觀看待這些,做出科學的選擇,接下來會詳細闡述。

如果不提取核酸,假陰性的概率會增加。

核酸提取是分子診斷實驗的“第壹步”,是非常重要的環節,因為pet樣本中的核酸必須先提取出來,才能進行後續的檢測,可見核酸提取的重要性。核酸提取有兩個主要目的:純化(消除樣品中的幹擾物質)和濃縮(增加樣品中核酸的濃度)。因為PCR檢測的樣本(血清、全血、細胞保存液、糞便等)中有很多幹擾物和抑制物。),核酸含量低,難以直接檢測核酸,靈敏度差。因此,在檢測之前,需要對樣品中的核酸進行裂解、純化和濃縮,即核酸提取。這是業內的主流做法。

比如臨床上壹些鼻咽拭子和口腔拭子的洗脫液就很簡單,幾乎是生理鹽水+少量分泌物+大量遊離病毒,不需要核酸提取就可以直接擴增。貓皰疹病毒FHV-1可以通過用棉簽在鼻子和嘴裏取樣來檢測。如果拭子的洗脫液是幹凈的,可以省略純化步驟,但不濃縮,降低了檢測的靈敏度。

此外,復雜的樣品必須進行核酸提取。例如,貓冠狀病毒(FCoV)大多在貓的腹水中檢測到。腹水樣本非常粘稠,含有大量蛋白質,無法直接檢測。這個樣本不經過提取直接放大,不是靈敏度下降的問題,而是檢測不出來的問題。

等溫擴增的缺點是成本高,很多產品需要專利保護。

等溫擴增儀簡單,檢測時間快,檢測靈敏度和PCR差不多。而等溫擴增技術多為國外發明,目前仍處於專利保護期,應用並不普及,成本也相對較高。

真空冷凍幹燥技術具有許多優點,是PCR試劑的發展趨勢。

PCR的試劑成分包括純化水、引物、聚合酶、Mg2+、dNTP和探針。這些成分混合後,在常溫下會逐漸降解失效。所以液體PCR試劑需要分裝到不同的小瓶中-20℃保存,使用時再解凍配制。因此,試劑的儲存、運輸和操作都很麻煩。

真空冷凍幹燥技術可以完全升華試劑中的水分,而不破壞有效成分。凍幹試劑可在室溫下儲存,無需冷鏈運輸。使用時加水溶解,然後就可以像普通PCR試劑壹樣使用,所以是PCR試劑的趨勢。

這裏介紹壹種全新的核酸擴增技術——蘇州先達基因(gendx.cn),以及具有完全自主知識產權的酶催化等溫擴增技術(ERA技術)。通過基因工程,多酶系統,如重組酶、核酸外切酶、聚合酶等。,進行了改造,建立了專門的擴增反應體系。在30-42℃的恒溫條件下,微量DNA/RNA的特定片段可在20分鐘內擴增出來。該技術具有PCR擴增的特異性和LAMP技術的方便性,準確性高。

它具有可檢測性、敏感性、快速性和特異性的優點。反應組分已混合並凍幹成幹粉,操作簡單,易於保存。而且全程自產,相對價格更有優勢。同時,配合其熒光恒溫擴增儀,可以實現核酸的現場檢測,不再受場地、時間、人員的限制。

分子診斷作為體外診斷技術的第四次革命,利用分子生物學方法檢測患者(寵物)體內遺傳物質結構或表達水平的變化,進而做出診斷,為疾病的預防、預測、診斷、治療和預後提供更準確的信息。與其他檢測方法相比,具有無可比擬的優勢。PCR作為分子診斷中最常用的檢測方法,在寵物的臨床診斷中將會越來越重要。同時,我們也相信我們首創的基因等溫擴增核酸檢測技術將以其檢測速度快、價格低廉的優勢在適時現場檢測市場中脫穎而出。

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