簡單來說，單細胞測序就是壹種獲取單個細胞遺傳信息的測序技術，看起來幫助並不大。為了理解這個問題，我們先來了解壹下測序技術能做什麽。
目前測序可以回答以下六個問題:
1.DNA序列:如何排列ATCG以及每個序列的豐度；
2.DNA的表觀遺傳修飾:如甲基化、羥甲基化和組蛋白的各種修飾；
3.RNA序列:AUCG如何排列，各序列的豐度；
4.RNA的表觀遺傳修飾:比如這幾年很流行的m6A修飾；
5.染色質結構:3C、4C、5C等C；
6.其他神奇的應用:如DNA損傷定位、蛋白質相互作用等。
單細胞測序就是要在單細胞水平上找到回答以上六種問題的方法。
二、為什麽要用單細胞測序？
如果換個方式問這個問題，就變成了，為什麽壹定要用單細胞測序？
世界上沒有兩片完全相同的樹葉。對於多細胞生物來說，細胞之間是有差異的。當然，這個差別可大可小。
比如，當受精卵從壹個細胞分裂出來，逐漸形成胚泡，最後發育成個體，細胞之間的差異會越來越大:有的分化成神經元，有的分化成骨骼肌，各自表達不同的遺傳信息，承擔不同的生理功能。
例如，在腫瘤組織中，腫瘤中心的細胞、腫瘤周圍的細胞、淋巴結轉移的細胞和遠處轉移的細胞及其基因組和轉錄組等遺傳信息存在差異。這種差異，在臨床上可以決定腫瘤對某種療法是否有效。
這就是遺傳信息的異質性。
傳統的研究方法是在多細胞水平上進行的。因此，最終的信號值實際上是多個細胞的平均值，這就失去了異質性的信息。為了讓大家更直觀的理解這個問題，我們不妨看看下圖:
為了檢測蛋白質的表達，我們可以使用蛋白質印跡和流式細胞術。但用Western blot，無法區分上述情況:目的蛋白在10%細胞中強表達，在50%細胞中中度表達，還是在所有細胞中弱表達？因為最終電泳出來了，是壹條強度差不多的帶。然而，如果使用流式細胞術在單細胞水平測量熒光強度，則可以區分上述情況。
同理，單細胞測序可以檢測出混合樣本測序無法獲得的異質信息。這將引領整個遺傳學領域進入壹個新的維度。
三、單細胞測序如何實現？
目前，實現單細胞測序主要有兩種策略。
第壹種方式，就像目前大多數人想象的那樣，是分離單個細胞，獨立構建測序文庫，最後測序。我們可以通過流式細胞儀(包括微流控芯片)或激光捕獲顯微切割(LCM)來實現這壹點。流式細胞儀估計大家都不陌生，就不多說了。主要用於細胞樣本。對於組織切片樣本，單細胞主要通過LCM獲得，原理見下圖示意圖。
而單個細胞壹個壹個分離，分別測序的通量很低，主要受限於成本。隨著待測單細胞數量的增加，測序的成本幾乎會線性增加。通常做十幾二十個電池會燒很多錢。但是，這幾十個細胞就足以說明問題了嗎？
為了克服這壹困難，近年來采用了第二種策略:基於條形碼的單細胞識別。它的主要思想是為每個細胞添加壹個唯壹的DNA序列，這樣在測序時，攜帶相同條形碼的序列就被視為來自同壹個細胞。這種策略可以通過壹次建立壹個數據庫來測量數百個單細胞的信息。
但是根據具體的測序類型，在細胞上添加條形碼的方案有很大的不同。對於RNA(轉錄組mRNA)，會更容易理解。由於在mRNA測序之前需要逆轉錄，我們只需要在poly T引物的5’端添加條形碼。參見以下示意圖(來自文件DOI:10.1038/nprot . 2016.154):
首先，通過微流控芯片將單細胞懸液樣品和帶有條形碼的水凝膠珠包裹在油滴中。在油滴中逆轉錄後，每個單細胞的cDNA文庫都帶有壹個唯壹的條形碼(藍色部分)。最後我們會把所有的單細胞cDNA文庫壹起測序，然後通過程序識別條形碼來區分單細胞。
如果測序對象是DNA，比如全基因組，就需要通過其他方式添加條形碼。目前主要是通過壹種經過修飾的高效轉座酶Tn5來實現。
基因轉座是指轉座子DNA從壹個染色體位點“跳躍”到另壹個染色體位點的過程。在這個過程中，轉座酶參與了。單細胞DNA測序利用了這壹特點。用轉座酶Tn5預組裝條形碼DNA，然後通過上述微流控技術將細胞和轉座復合物包裹在油滴中。隨後，轉座酶將條形碼插入基因組DNA。這個過程在文獻中也稱為標記。
然而，基於Tn5的條形碼的復雜性(即可以有多少個唯壹的條形碼)仍然有限。為了保證標記的效率，上圖中的紅色條碼區域不能太長。同時，為了避免測序錯誤導致的誤識別(比如壹個堿基不小心測錯了，卻被當成了另壹個條碼)，而且條碼的復雜度沒有4的n次方那麽高，所以需要引入修正機制。我就不細說了。壹般來說，Tn5單獨壹次只能識別幾十到幾百個單細胞。
為了提高復雜度，即壹次可以捕獲的單細胞數量，目前的解決方案是走組合索引的路線。(見下圖，來自文件DOI:10.1038/nmeth . 4154)。
其主要思想是通過兩步反應兩次添加標簽。首先將單細胞懸液放在多孔板中，用轉座酶Tn5將第壹個條形碼加入細胞中，其中每個孔中的條形碼是不同的。然後將樣品混合在壹起，將少量細胞分選到含有PCR引物的多孔板中，通過流式細胞儀進行數據庫構建。這些引物有第二輪條形碼。因此，在轉座Tn5並通過PCR標記後，大多數細胞可以攜帶獨特的條形碼。
看了這個，肯定有人發現這個方案的問題了。例如，如果在流動分選過程中，在第壹個孔中分離出兩個或兩個以上的橙色細胞，然後用PCR將它們標記為紅色，則不能區分這兩個單細胞。
的確，組合索引可能會有65，438+00%的沖突率，也就是說，有可能將兩個單個單元格誤認為是同壹個單元格。該值取決於第壹步標記的復雜度(復雜度越高，沖突率越低)和排序時分配給每個孔的像元數量(數量越少，沖突率越低)。然而，組合索引可以壹次識別數千個單細胞，並將通量增加數十至數百。魚和熊掌取決於實驗者的選擇。
單細胞測序素養:是什麽？為什麽？怎麽會？