RT-PCR英文是逆轉錄聚合酶鏈式反應的縮寫，中文叫逆轉錄聚合酶鏈式反應。在逆轉錄酶M-MLV或AMV的作用下，以RNA為模板，以約20個核苷酸為引物，逆轉錄合成cDNA。然後以cDNA為模板，兩個具有3和5個互補末端的寡核苷酸引物，Taq聚合酶進行從5到3的壹系列DNA聚合反應，擴增出想要的DNA，可以將極少量的靶DNA特異性擴增數百萬倍，從而大大提高了分析檢測DNA分子的能力。
通過使用PCR技術，可以檢測每65438+百萬個細胞僅包含1個靶核酸分子的單分子核酸或樣品。因此，這項技術自十年前建立以來，迅速形成了壹套常規的標準程序，為生物科學從微生物材料中快速獲得大量特定的遺傳物質提供了壹種實驗手段。PCR在植物病毒的檢測、鑒定和檢疫方面也將具有重要意義。如果病毒核酸是DNA型，就不需要逆轉錄(RT)，可以直接進行聚合酶鏈擴增(PCR)。而大部分植物病毒的核酸類型是RNA，所以首先需要逆轉錄(RT)，然後需要聚合酶鏈反應(PCR)擴增。擴增的片段可以用1%瓊脂糖和5%聚丙烯酰胺電泳檢測。
以香石竹斑駁病毒為例，介紹了RT-PCR檢測香石竹斑駁病毒的實驗技術。
用已知病毒核酸的保守序列設計引物，提取病株和健康植株的總RNA作為模板，進行RT-PCR反應，用瓊脂糖或PAGE電泳檢測擴增結果。感病材料會出現特定的擴增帶。如康乃馨斑駁病毒(CarMV)。根據病毒的RNA序列，引物p 1(5’引物，與CarMV RNA的2516 ~ 2538同源):5’-[TTA，GTT，TGC，CCC，CGT，TGG，TAA，CC]-3’。P2引物(3’互補引物，對應CarMV RNA的3100 ~ 3124):5’-[AAG，CGT，CAT，CGT，TGA，ATC，CCA，gag]-3’。目標碎片大小為608nt。對感病材料進行RT-PCR，從感病材料中擴增出約600bp的特異片段，而健康植株沒有此擴增帶。該方法可以快速準確地檢測香石竹斑駁病毒。操作如下所示:
(1)RNA提取
分別取病葉和健葉各0.2~0.5g，加入液氮研磨成粉，按1g ∶ 2ml的比例懸浮於RNA提取緩沖液(20mmol/L Tris-HC1 pH8.0，1mmol/L EDTA，1%SDS，0.2%巰基乙醇)中。按照1的比例加入苯甲酸-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)的水飽和混合物，提取數次，用乙醇沈澱總RNA。溶解在20 ~ 50μ l TE緩沖液中，並儲存在-70℃的冰箱中。
(2)2)cDNA合成反應系統的組成如下
待測材料總RNA或健康材料總RNA為0.5/μg，20pmol/L引物P21μl，5×MMLV緩沖液4μl，ddH2O7μl，混合溶液在88℃處理10min，然後在冰上快速冷卻，然後加入10 mmol/L DNTPS 1μL . 40u/μL RNase sin 0
(3)PCR擴增
取上述cDNA 0.5μg，分別加入5μL 10×PCR緩沖液、20pmol/L引物P1和引物P2 1μl、10 mmol/ldntsps1 μ l，88℃10min內ddH2O。然後在液面上滴三滴石蠟油，進行如下PCR熱循環:94℃3min，60℃1min，72℃1min，1min；94℃40s，60℃1分鐘，72℃1分鐘，35個循環，最後72℃10分鐘。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。帶有CarMV的樣品將具有600bp的特征性擴增帶。如圖1所示。
圖1 CarMV PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果。
1.純化病毒材料的PCR擴增2。感染組織的PCR產物。健康組織的PCR產物。分子量標準。
RT-PCR是檢測植物病毒最敏感的方法之壹。其靈敏度比ELISA高100 ~ 1000倍。比核酸分子雜交高10 ~ 100倍。目前，花卉病毒如PVY、CMV、CarMV、TAV、CVB、ToRSV、TRSV、PNRSV等都有特異性引物和成熟的RT-PCR技術。
2核酸分子雜交
核酸分子的雜交是基於植物病毒的RNA或DNA鏈之間堿基配對的基本原理。當雙鏈DNA分子被加熱時，鏈之間的氫鍵被破壞，兩條鏈被分開。當變性分離的單鏈冷卻後，堿基的氫鍵重新形成，雙鏈恢復。在變性的RNA或DNA單鏈上加入同位素或非同位素標記制成探針，與待測樣品的RNA或DNA進行堿基特異性配對，形成穩定的雙鏈分子，通過檢測同位素放射性和非同位素顯色或熒光來檢測樣品的RNA或DNA是否與探針雜交。根據已知的病毒核酸序列，設計引物，從標準陽性材料，即壹些已經分離鑒定的病毒材料中提取總RNA，用逆轉錄酶形成cDNA，用同位素或非同位素標記制備探針，與待測樣品進行分子雜交。如果能雜交並呈陽性，說明待測樣品中含有被鑒定的病毒。該方法可以快速有效地檢測植物攜帶的病毒。
用於檢測的雜交包括斑點印跡雜交和核酸印跡轉移雜交。點雜交是將待測樣品的DNA或RNA和汁液點在硝酸纖維素膜上，幹燥後與同位素或非同位素標記的探針雜交，檢測樣品中是否存在待測病毒。斑點雜交是壹種快速、簡便、經濟的病毒快速檢測和鑒定方法。核酸印跡轉移雜交需要用限制性內切酶將待測樣品的DNA或RNA切割成大小不同的片段，然後電泳後從凝膠轉移到硝酸纖維素膜上，幹燥後再與同位素或非同位素標記的探針雜交，從而檢測樣品中是否存在待測病毒。
核酸分子的雜交靈敏度沒有RT-PCR高，但這種技術不受不同毒株病毒的影響，沒有毒株特異性。
不同的實驗方法靈敏度不同(表1)，可以根據需要選擇。
表1不同實驗方法測定植物病毒的敏感性比較