1,電泳法
壹般核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳;如果需要高分辨率的電泳,特別是相差只有幾個bp的情況下,應選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳;脈沖凝膠電泳應該用於不適合普通電泳的巨大DNA鏈。
2.凝膠濃度
對於瓊脂糖凝膠電泳,濃度通常在0.5 ~ 2%之間,低濃度用於核酸大片段的電泳,高濃度用於小片段分析。低濃度的膠是易碎的,所以小心操作和好質量的瓊脂糖是解決辦法。
3.緩沖溶液
常用的緩沖劑有TAE和TBE,TBE的緩沖能力比TAE好。使用新配制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。
4.電壓和溫度
電泳時,電場強度不得超過20V/cm,電泳溫度應低於30℃。對於巨DNA電泳,溫度應低於65438±05℃。
5.DNA樣本的純度和狀態
應註意的現象是,樣品中的鹽含量過高以及含有雜質的蛋白質會產生模糊帶和缺失帶。乙醇沈澱可以去除多余的鹽,苯酚可以去除蛋白質。
6.DNA取樣
正確的DNA上樣是清晰條帶的保證。註意,過多的DNA加載可能導致模糊的DNA條帶模式,而過少的DNA加載可能導致弱的甚至缺失的條帶信號。
7.標記的選擇
DNA電泳必須使用已知大小的DNA標記或陽性對照DNA來估計DNA片段的大小。標記應選擇目標碎片大小附近階梯密集的,以便更準確地估計目標碎片大小。
8.凝膠的染色與觀察
溴化乙錠(EB)是實驗室常用的核酸染色劑,染色效果好,操作方便,但穩定性差,有毒性。觀察凝膠時應註意根據不同染料使用合適的光源和激發波長。如果激發波長不對,波段就不容易觀察到,波段也會模糊。
二、註意事項:
1,龐大的DNA鏈可能無法通過普通電泳跑出膠孔,導致條帶缺失。
2.高濃度的膠水可能會使分子大小相近的DNA條帶難以區分,導致條帶缺失。
3.電泳緩沖液多次使用後,離子強度下降,pH值升高,緩沖性能下降,可能導致DNA電泳出現條帶模糊、DNA條帶遷移不規則的現象。
4.如果電泳時電壓和溫度過高,可能導致條帶模糊,DNA條帶遷移不規則。尤其是電壓過高,可能會造成小碎片跑出膠外,出現漏帶現象。
5.變性的DNA樣品可能導致條帶模糊和缺失,也可能發生不規則的DNA條帶遷移。加載前不要加熱DNA樣本。用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。
6.過多的DNA加載可能導致模糊的DNA條帶模式,而過少的DNA加載可能導致弱的甚至缺失的條帶信號。
擴展數據
瓊脂糖凝膠具有網狀結構,物質的分子通過時會受到阻力,大分子湧動時會受到很大阻力。所以在凝膠電泳中,帶電粒子的分離不僅取決於凈電荷的性質和數量,還取決於分子的大小,大大提高了分辨率。
但由於其孔徑與蛋白質相比過大,對大多數蛋白質而言,其分子篩效應可忽略不計,目前廣泛應用於核酸研究。
蛋白質和核酸根據不同的pH值會帶不同的電荷,在電場中會受到不同的力,所以會以不同的速度運行。根據這個原理,它們是可以分開的。電泳緩沖液的pH值在6-9之間,最佳離子強度在0.02-0.05之間。1%瓊脂糖通常用作電泳支持物。
瓊脂糖凝膠可以區分相差約100bp的DNA片段。雖然它的分辨率低於聚丙烯酰胺凝膠,但它易於制備,分離範圍寬。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的範圍為0.2-20kb,脈沖電泳可分離高達10 7bp的DNA片段。
DNA分子在瓊脂糖凝膠中遊動時具有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在等電點以上的pH溶液中帶負電,在電場中向正電極移動。由於糖-磷酸骨架的重復結構,相同數目的雙鏈DNA的凈電荷幾乎相同,因此它們可以以相同的速度向正極移動。
百度百科-瓊脂糖凝膠電泳