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非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的實驗步驟

1,PAGE凝膠電泳緩沖液配置

1)丙烯酰胺單體儲存液:14.55g丙烯酰胺和0.45g N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺,用40mL雙蒸水攪拌溶解至溶液變透明,再用雙蒸水稀釋至50mL,過濾。儲存在4°C的棕色瓶中以備後用。

2)濃縮凝膠緩沖液(0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8):將3.03 gtris溶於40mL雙蒸水,用4mol/L鹽酸調節pH至6.8。然後用雙蒸水稀釋到50毫升。在4°c下保存以備後用。

3)分離凝膠緩沖液(1.5mol/L Tris-HCl,pH8.9): 18.16 GTRIS溶於80mL雙蒸水,用4mol/L鹽酸調節pH至8.9。用雙蒸水稀釋至100mL,並儲存在4°C下以備後用。

4)10%(AP)過硫酸銨:0.1g過硫酸銨溶於1.0mL雙蒸水,使用前新鮮配制。

5)電極緩沖液(0.025mol/L Tris,0.2mol/L甘氨酸,pH 8.3): 15.14gtris加72.07g甘氨酸,用雙蒸水稀釋至5L。它可以在室溫下保存壹個月。

6)樣品緩沖液(0.1mol/L Tris-HCl,pH 6.8): 2ml濃縮凝膠緩沖液,1mL87%甘油和0.1mg溴酚藍,用雙蒸水稀釋至10mL,可在-20℃保存6個月。

2.Native-PAGE配方分離凝膠:6.6毫升30%丙烯酰胺雙蒸水溶液,8.0毫升1.5摩爾/升tris (pH 8.8)和5.0毫升10%過硫酸銨溶液(W/V)。200μl TEMED 15μl濃縮凝膠:雙蒸水6.8ml 30%丙烯酰胺溶液1.7ml 0.5mol/l tris(pH 6.8)1.25ml 10%過硫酸銨溶液(W/V) 100μ l temed。

用雙蒸水清洗玻璃板、橡膠墊和梳子,用酒精棉球擦拭,安裝電泳槽,按表1配制分離膠(12%)和濃縮膠(5%)。最後加入過硫酸銨和TEMED,加入後開始聚合。它們應該立即混合並倒入兩個玻璃板之間。分離膠應倒在兩塊玻璃板之間,留有合適的高度,使取樣孔前端距分離膠約2.5cm。將高度約0.5cm的雙蒸水慢慢加入膠的頂部。分離膠完全聚合後,倒掉上層的雙蒸水,用雙蒸水清洗凝膠頂層,用吸水紙吸掉殘留的水滴。將濃膠倒入玻璃板夾層中,插入梳子,待濃膠完全聚合後拔出梳子,立即用雙蒸水清洗樣孔。加入電極緩沖液,用微量取樣器在取樣孔底部點樣,在200伏電壓下進行電泳。當溴酚藍到達分離凝膠時,電壓變為250伏,繼續電泳直到溴酚藍到達凝膠底部。剝離凝膠,浸泡在100ml底物溶液中,染色1小時,膠帶顯色後立即拍照。然後凝膠用考馬斯亮藍染色。

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