條件基因敲除小鼠的設計使用了Cre/LoxP或Flipe/Frt的原理。它們都是位點特異性重組酶系統。這裏以Cre/LoxP系統為例。例如，壹個loxP序列被置於待敲除的靶DNA序列的兩端。獲得Flox(側翼為loxP)小鼠。將flox小鼠與細胞特異性表達Cre的小鼠交配，獲得特定細胞中靶基因敲除的小鼠，即條件基因敲除小鼠。此外，如果與其他誘導系統(如CreERT2)結合來控制CREE表達，壹個基因可以在時間和空間上受到調控。
Cre/loxP系統來源於噬菌體，可介導位點特異性DNA重組。該系統由兩個部分組成:壹個是34bp長的DNA序列(LoxP序列)，它包含兩個13 bp的反向重復序列和壹個8 bp的核心序列。LoxP的方向由中間的八個堿基決定。這個LoxP序列就是Cre重組酶識別的位點，Cre重組酶是由噬菌體編碼的343個氨基酸組成的蛋白質。Cre可以介導兩個LoxP位點的重組。因此，導致兩個LoxP序列之間的DNA序列缺失。如果通過基因工程將Cre重組酶的cDNA置於組織或細胞特異性啟動子下，可以獲得Cre組織/細胞特異性表達的Cre小鼠，也稱為Cre工具小鼠。與Flox小鼠交配後，可獲得條件基因敲除小鼠。
所謂Flox鼠是指將LoxP序列放在壹個基因的外顯子兩側。該序列的側翼是LoxP，也稱為Flox mouse。這種Flox小鼠壹般是通過設計和構建靶向載體，重組胚胎幹細胞，顯微註射胚泡，傳代嵌合小鼠獲得的。該鼠標與Cre工具鼠標配對。由於Cre的表達，介導兩個LoxP位點序列的重組，從而敲除兩個LoxP之間的序列。由於Cre在不同Cre工具小鼠中的表達具有組織/細胞特異性，可以在不同的組織和細胞中特異性敲除目的基因，如上皮細胞、胸腺細胞、T細胞、B細胞、心肌細胞、腸、肺等。