1，真菌顯微鏡檢查
它是最簡單、最有價值的實驗室診斷方法。其優點是簡單、快速，無菌部位陽性結果可直接判定真菌感染。但由於陽性率低，陰性結果不能排除診斷。直接顯微鏡檢查對淺表和皮下真菌感染最有幫助。在皮膚碎屑、頭發或指甲標本中發現的皮膚真菌、念珠菌和馬拉色菌的成分可以提供相應真菌病的可靠診斷。例如，如果在無菌體液的直接顯微鏡檢查中發現真菌成分，如腦脊液中有包膜的新型隱球菌酵母細胞或外周血塗片中的莢膜組織胞漿菌細胞，通常可以確定深部真菌病的診斷。但壹般來說，只有在細菌部分發現大量真菌菌絲才有意義。通過直接鏡檢，壹般可以區分念珠菌、隱球菌、黑暗真菌、毛黴(接合菌)等細菌的感染，進壹步的菌種鑒定需要通過培養鑒定來完成。
2.真菌培養
真菌培養是實驗室檢驗的重要環節，培養致病真菌是進壹步鑒定菌株的前提。真菌培養的第壹步是從臨床標本中進行真菌的原代培養，原代培養後再進行進壹步的分離、純化和鑒定培養。不同病原真菌每壹步的培養基、培養時間和培養溫度都有所不同。常規真菌培養需要在28-30℃培養3-4周。壹般采用沙氏培養基(SDA)或土豆瓊脂培養基(PDA)進行原代培養，兩管同時培養，壹管可加入抗生素(氯黴素或慶大黴素)。在培養的1周內，每天都要觀察是否有真菌生長。壹般培養4周後，如無真菌生長，可報陰性。發現培養的真菌可直接從少量細菌中選取或小規模培養，然後用酚靛乳酸塗片，在顯微鏡下觀察。結合菌落的壹般形態，可以直接將典型菌株報告給該種。根據基本性能，非典型菌株應在適當的標準鑒定培養基和標準培養條件下培養，必要時結合生理和分子生物學方法進行鑒定。
3.真菌的鑒定
常見致病真菌的鑒別原則是先區分酵母菌和黴菌。
如果在原代培養基上培養出酵母樣菌落，應在鑒定前進行分離純化。去除細菌和其他真菌的汙染並區分混合感染後，鑒定純菌落。酵母菌的鑒定主要是根據形態特征和生理生化特征，按照壹定的流程進行。首先，根據顏色對菌落進行分類。臨床最常見的細菌為白色或乳白色菌落，進壹步用芽管試驗檢測。如果芽管試驗陽性，則為白色念珠菌，如果陰性，則通過Vitek YBC或API20C與玉米吐溫瓊脂的形態特征進行鑒定。此外，念珠菌顯色瓊脂和尿素酶試驗也可用於輔助鑒定。
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黴菌的鑒定非常復雜，有許多標準，包括形態特征、耐溫性、環己酰亞胺抗性、雙相性、營養需求、蛋白水解活性和水解尿素的能力。現代分類鑒定方法主要是根據分生孢子的個體發育過程，結合其他特征。初級培養後，壹般可根據形態特征進行屬級鑒定，然後根據不同真菌的鑒定要求，使用標準培養基和培養條進壹步完成菌株鑒定。例如，在鑒定曲黴菌時，需要使用標準培養基，即夏科培養基和麥芽瓊脂。在25℃培養7天後，對照曲黴形態鑒定關鍵表即可得到正確結果。