1.4.1傳染性測定方法
傳染性測定方法是將病毒樣品接種在植物上,根據傳染性進行量化。它的靈敏度在所有定量方法中是比較高的,是其他定量方法的基礎。設計壹種新的定量方法,如果不通過傳染性驗證,將無法判斷是病毒還是具有傳染性的病毒。侵染率測定方法包括局部枯斑法、澱粉碘斑法、系統侵染率測定法等。在傳染性測定中,常采用粗汁接種。為了避免抑制物質的作用,將半葉枯病的數量控制在壹定範圍內,接種物必須用緩沖液稀釋。
局部死斑法1929 F.O.Holmes發現,TMV在粘性煙草接種葉片上引起局部壞死斑,產生的斑數在壹定範圍內與病毒濃度成正比。這壹發現成為定量測定病毒傳染性的基礎(田波,1987)。將局部斑點法應用於所有機械傳播的病毒是可能的,但事實上只有少數病毒具有可用於定量測定的局部斑點宿主。待測樣品形成的斑點數量不僅取決於接種物中的病毒濃度,還取決於植物種類、環境條件以及接種物是否含有病毒抑制物質。
當所研究的病毒沒有過敏性枯萎病宿主時,使用澱粉-碘斑點法。Holmes(1931)發現接種TMV的煙葉有時會形成明顯的黃化斑,但不能用於計數。當接種葉片用95%乙醇加熱至80℃後,用碘和碘化鉀的混合溶液(10g碘,30g碘化鉀,1500ml H2O)染色時,在侵染點出現澱粉-碘的藍色反應。下午采摘葉子,隔夜褪色,再用碘液染色,染病點比周圍組織淺;在采摘葉子之前,要把植株放在暗處幾個小時,然後用碘溶液染色,這樣受感染的組織就會被染得很深。這是因為病毒感染不僅減少了光合組織中碳水化合物的形成,也減少了光合組織中碳水化合物的運輸。澱粉-碘染色強度受環境條件影響較大,不如局部枯斑法可靠,但仍可用於標準化條件下傳染性的定量測定。
感染性滴定度法當上述方法不適用時,可以使用感染性滴定度法。即待測樣品用緩沖液稀釋,可以稀釋10倍、2倍、壹半或更低。這種方法的缺點是需要大量的實驗植物,但可以得到很好的結果。這種方法可用於媒介傳播的病毒。