病原微生物學免疫診斷技術綜述

摘要：病原微生物種類繁多，變異迅速，快速鑒定病原微生物的檢驗技術也在不斷發展前進著。目前，應用比較廣泛的病原微生物檢測方法主要有直接塗片鏡檢、分離培養、生化反應、血清學反應、核酸分子雜交、基因芯片、多聚酶鏈反應等，該文對這些檢測技術進展做壹綜述。對人和動物具有致病性的微生物稱為病原微生物，又稱病原體，有病毒、細菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、真菌、放線菌、朊粒等。這些病原微生物可引起感染、過敏、腫瘤、癡呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之壹。近年來出現的SARS、高致病性禽流感、西尼羅病毒感染等疾病的傳染性極強，往往造成世界性大流行，因此對病原體的檢測必須做到快速、準確。常規病原學檢測方法操作繁瑣，檢測周期長，而且對操作人員技術水平要求比較高。隨著醫學微生物學研究技術的不斷發展，病原學診斷已不再局限於病原體水平，深入到分子水平、基因水平的檢測手段不斷出現並被應用於臨床和實驗室 J。核酸分子雜交技術、PCR技術、基因芯片技術等檢測方法，自動化程度高，快速省時、無汙染、結果精確，可以準確靈敏地鑒定病原微生物。1 傳統的病原微生物的檢測方法傳統的病原微生物學實驗室檢查以染色、培養、生化鑒定等為主，將標本直接塗片染色鏡檢和接種在培養基上進行分離培養是對細菌或真菌感染性疾病進行病原學診斷的常用方法。1．1 直接塗片鏡檢病原微生物體形體積微小，大多無色半透明狀，將其染色後可借助顯微鏡觀察其大小、形態、排列等。直接塗片染色鏡檢簡便快速，對那些具有特殊形態的病原微生物感染仍然適用，例如淋球菌感染、結核分枝桿菌、螺旋體感染等的早期初步診斷。直接塗片鏡檢不需要特殊的儀器和設備，在基層實驗室裏仍然是十分重要的病原微生物檢測手段。1．2 分離培養與生化反應分離培養主要用於臨床標本(如血液、痰、糞便等)或培養物中有多種細菌時對某壹種細菌的分離。細菌的生長繁殖需要壹定時間，檢測周期較長，不能同時處理批量樣本。為解決這壹問題，各種自動化培養和鑒定系統不斷產生，傳統鑒定方法也在逐步改進，大大加快了檢驗速度。例如Microscan WalLCAway全自動微生物分析儀，可同時做細菌鑒定和藥敏試驗，檢驗500多個菌種。苛養菌如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌等對營養要求比較高，常規培養陽性率低。雍剛等將不要同比例的葡萄糖、玉米澱粉、生長因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌劑加入到巧克力培養基中制成了新型淋病奈瑟菌培養基，大大提高了淋病奈瑟菌的分離培養率。蘇盛通等在營養瓊脂中加人了中藥紅棗、赤小豆培養甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌等細菌，生長指數明顯高於血平板。1．3 組織細胞培養活組織細胞培養適於專營活組織細胞內生存的病原體，包括病毒、立克次體、衣原體等。不同病原體敏感的組織細胞是不壹樣的，將活細胞從病原體敏感的動物組織中取出在體外進行原代培養或用病原體敏感細胞系進行傳代培養，再將病原體接種於相應的組織細胞中後，病原體可在其中繁殖增長，引起特異性的細胞病變效應。也可以將病原體直接接種於敏感動物體內，引起相應組織器官出現特異的病理學改變。往往可以根據這些特異的病變對病原體進行鑒定。2 血清學與免疫學檢測血清學檢測是通過已知的抗體或抗原來檢測病原體的抗原或抗體從而對病原體進行快速鑒定的技術，簡化了鑒定步驟，常用的方法包括血清凝集技術、乳膠凝集實驗、熒光抗體檢測技術、協同凝集試驗、酶聯免疫測試技術等。酶聯免疫技術的應用大大提高了血清學檢測的敏感性和特異性，不僅可檢測樣本中病原體抗原，也可檢測機體的抗體成分。幽門螺奸菌在我國人群感染率高達50％～80％，應用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測唾液中抗HP抗體來診斷HP感染，其結果滿意。乙型肝炎病毒(HBV)在我國人群中感染率極高，ELISA應用於乙型肝炎病人早期血清學診斷的效果最為明顯。臨床上致病菌往往和非致病菌混合在壹起，如何從這些細菌中分離出目標菌是關鍵。免疫磁珠分離技術(IMBS)是近年來發展起來的在微生物檢測領域中壹種新技術。其基本原理是將特定病原體的單抗或多抗或二抗偶聯到磁珠微球上，通過抗原抗體反應形成磁珠壹目標病原體復合物或磁珠壹壹抗壹目標病原體復合物，在外部磁場磁力的作用下，將目標病原體分離出來。目前已經開發出了針對各種病原體的免疫磁珠，如大腸埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、軍團菌等，廣泛應用到各級科研和實驗室。經IMBS分離出的白色念珠菌可直接在顯微鏡下檢測，檢測時間縮短至4 h。IM—Bs還可以和其它檢測技術聯合來檢測病原菌，免疫磁珠分離得到的目標菌可繼續用於分離培養使大腸埃希菌0157最低檢測限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g～；IMBS結合聚合酶鏈反應(IMBS—PCR)可對培養條件比較特殊的細菌如苛養菌、厭氧菌進行快速檢測，肉類中的產毒素型產氣莢膜梭菌經IMBS．PCR檢測，檢測時間縮短到10 h，最低檢測限可達10cfu·g～，有研究者利用IMBS結合實時熒光定量PCR(IMBS—RT—PCR)成功檢測出了水中的輪狀病毒和草莓的諾如病毒，檢測時間大大縮短；Leon—Velarde等利用IMB8結合酶聯檢測，大大提高了沙門菌的檢測效率。3 基因檢測隨著科技水平發展，分子生物學檢測技術日新月異，對病原微生物的鑒定已不再局限於對普通外部形態結構和生理生化特性等的壹般檢驗上，而是深入到了分子水平、核酸水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特異的，有別於其他種或屬，檢測其特有的基因片段序列可用來鑒別病原微生物。隨著科技的發展，基因檢測技術逐漸代替其它檢測技術，成為臨床檢驗科和基礎實驗室對病原體的主流檢測技術。3．1 核酸雜交技術具有壹定互補序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補配對原則締成異質雙鏈的過程叫核酸雜交，其雜交雙方是所使用探針和要檢測的核酸。在病原微生物檢測中核酸分子雜交主要包括膜上印跡雜交和核酸原位雜交兩種。膜上印跡雜交是指將核酸從微生物細胞中分離出來，純化後在體外結合到壹定的固相支持物上，與存在於液相中標記的核酸探針進行雜交。核酸原位雜交是指標記的核酸探針直接與細胞或組織切片中的核酸進行雜交。探針還可以用熒光標記，在熒光顯微鏡或激光掃描***聚焦顯微鏡下即可鑒別病原體還可顯示在三維空間中的位置。核酸分子雜交檢測技術與其它方法相比顯著地優點是簡便、敏感、快速、特異。Wong 等用熒光標記2個不同的寡核苷酸探針從血液標本中檢測出假單胞菌屬和不動桿菌屬的細菌，最低檢測限為10 cfu·mL～，特異度為100％，檢測時間不到2 h。寡核苷酸探針是針對病原體特異基因序列設計的，可以將待檢測的病原體定位在不同的分類等級，如科、屬、種、亞種“ 。（病原微生物檢測技術進展）3．2 基因芯片技術基因芯片(DNA chip)又稱為DNA微陣列(DNA microarray)或DNA芯片，是生物芯片的壹種 j，是核酸分子雜交技術發展延伸而來的。通過微加工技術，將數以萬計甚至百萬計的基因探針即DNA片段有規律地排列成二維DNA探針陣列，固定到矽片、玻片等固態支持物上，與標記的樣品分子進行核酸雜交，用於基因檢測工作。其測序原理與核酸雜交壹樣，但解決了傳統核酸雜交技術操作繁雜、檢測效率低、自動化程度不高的缺點。基因芯片在病原微生物感染診斷上的應用，大大縮短了確診所需要的時間，而且能檢測出病原體是否耐藥、對那些抗生素耐藥、對那些抗生素敏感。Naas 等設計的基因芯片可以檢測出銅綠假單胞菌、腸桿菌屬、鮑氏菌屬中各型B壹內酰胺酶類耐藥基因。蔡挺等設計的基因芯片檢測出大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動桿菌、陰溝腸桿菌對l7種抗菌藥物的耐藥率。Batchelor 等開發的基因芯片可以檢測出編碼耐超廣譜8．內酰胺酶、磺胺類、四環素類、氨基糖甙類等47個耐藥基因的大腸埃希菌和沙門氏菌。基因芯片技術同樣還有些問題有待解決，如提高芯片的特異性和檢測信號的敏感性，降低芯片的制作成本等，而且多數芯片都需要昂貴的檢測儀器，這些問題使得基因芯片到目前主要局限於實驗室研究而未能廣泛應用於臨床病原微生物的檢測與鑒定。（病原微生物檢測技術進展）3．3 PCR技術聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是壹種在體外是用已知寡核苷酸引物引導未知片段中微量待測基因片段並進行擴增的技術。由於PCR可以對待測基因進行擴增，特別適用於病原體感染早期的診斷，但是如果引物特異性不強，可能會造成假陽性的出現。PCR技術在近20年裏發展迅速，從基因擴增到基因的克隆和改造以及遺傳分析，可靠性逐步提高。Jbara 用PCR和傳統法直接檢測75例樣本中的流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌，與傳統方法相比，PCR檢測的特異度和靈敏度分別為87．3％和100％。1988年Chamberian等提出了多重PCR的概念，同壹PCR反應體系裏加上二對以上引物，可同時擴增出多個核酸片段，適合大量樣本的分析與鑒定。多重PCR具有：(1)高效性，在同壹反應體系內可同時檢出多種病原微生物，或對同壹病原微生物的不同型別進行分型；(2)系統性，多重PCR很適宜於成組病原體的檢測，如幾種肝炎病毒同時感染；淋球菌、梅毒螺旋體、艾滋病病毒等多重性病病原體的感染；需特殊培養的無芽胞厭氧菌感染；破傷風桿菌，炭疽桿菌，產氣莢膜桿菌，鼠疫耶爾森菌等戰傷感染細菌感染；(3)經濟簡便性，多種病原體在同壹反應管內同時被檢出，節省試劑、節約費用、節省時間，為臨床提供更快更多更準確的診斷信息。Reyes等用多重PCR從90例發熱但培養陰性的兒童細菌性腦膜炎腦脊液樣本中檢測出了腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌，特異度100％，敏感度89％。實時熒光定量PCR，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程。具有高度靈敏、高度特異、有效解決PCR汙染問題、自動化程度高等特點。實時熒光定量PCR對性病病原體早期確診、窗口期篩查、療效檢測、基因變異分析和預後評估等具有重要價值，為流行病學調查提供幫助 J。王娉等建立了多重實時熒光定量PCR反應體系，同壹體系能同時快速檢測出耐甲氧西林和產腸毒素A的金黃色葡萄球菌。熒光基團標記的特異性引物可準確反映病原體感染和藥物療效，特別適用於不可人工培養和難以培養的病原體如病毒、衣原體等感染的診斷。基因芯片技術與多重PCR結合可以通過PCR對目的基因進行放大，通過基因芯片的熒光探針增加檢測的靈敏性和特異性，使得兩種檢測技術的優勢互補，已廣泛應用於病原微生物的檢測。將病原體特異性基因作為靶基因設計出引物與探針，進行多重PCR擴增，制備出寡核苷酸芯片，再對待測樣本靶基因進行多重PCR擴增，將擴增產物與病原菌多重PCR基因芯片檢測體系雜交，可根據雜交信號直觀地判讀樣品中所含病原體的種類、型別、毒力、侵襲力，從而對病原體進行檢測和鑒定。（病原微生物檢測技術進展）3．4 其它基因檢測技術分子生物學技術飛速發展，各種新的基因檢測手段不斷出現。Notomi等於2000年開發出壹種新的環介導恒溫核酸擴增法(1oop—mediated isothermal amplifi—cation of DNA，簡稱LAMP)，針對靶基因序列上6或8個特異區域設計出4或6條引物，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下形成環狀結構和鏈置換對目標DNA大量擴增。短短幾年LAMP已被廣泛應用於疾病診斷、食品檢驗、環境監測、生物安全等各方面心 ]。李蒙等運用LAMP法60 min檢測了16例開放性傷口深部傷口感染分泌物中的破傷風芽孢梭菌，其中陽性為4例，最低檢測限為4 x 10 。有研究報道l2 用LAMP技術快速檢測了200例肺結核患者的痰標本，結核分枝桿菌的陽性檢出率遠遠高於培養法和染色法。多位點可變數目串聯重復序列分析(Multiple—locus Variable—nun—ber Tandem repeat Analysis，MLVA)是壹種根據病原體基因組中可變數目串聯重復序列的特征來對病原體基因分型的壹種技術，廣泛應用於金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、炭疽芽胞桿菌等的基因分型與鑒定 ?。4 小結與展望對病原體進行快速準確的檢測和鑒定是傳染病防治工作的首要問題。隨著生物學研究由宏觀領域向微觀領域的發展，病原體檢測方法也從組織形態學水平深入到分子水平、基因水平。近年來發展起來的病原微生物高通量檢測技術樣本需要量少、快速省時、無汙染、診斷結果精確、自動化程度高，相信隨著研究的不斷進展和深入，這些高通量診斷技術和方法必將在病原微生物的診斷分析方面起到越來越重要的作用，而多種檢測技術的聯合和綜合更是有著廣闊的應用前景。