壹、原理
在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。
目前常用的保護劑為二甲亞碸（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。
二、操作步驟
（壹）凍存
1、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。
3、沈澱加含保護液的培養，計數，調整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。
5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口壹定要嚴，否則復蘇時易出現爆裂。
6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴壹金屬重物和壹細繩。
7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態氮（30分鐘）→液氮。
註意：操作時應小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，絕對不能揮發幹凈，壹般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）復蘇
1. 細胞實驗室進行常規消毒，紫外照射40min以上。
2. 培養液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預熱20min，備用。
3. 二甲基亞碸（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，備用。
4. 從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400C水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。
5. 將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養液，離心（1000r/min，5min）。
6. 用培養液懸液混懸沈澱細胞，調整細胞濃度，方培養箱中培養。
7. 記錄復蘇日期。
註意事項
1. 取細胞的過程中註意帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。
2. 凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這裏不作詳述，但二甲基亞碸（DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞碸對細胞的毒副作 較大，因此，必須在1-2min內使凍存液完全融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞碸（DMSO）最好選擇進口產品。
3. 離心前須加入少量培養液。細胞解凍後二甲基亞碸濃度較高，註意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。
4. 離心問題：目前主要有兩種見解。壹種是解凍後的細胞懸液直接吹打均勻後分裝到培養瓶中進行培養，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除 DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對壹般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沈底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大， 死亡。此外在操作過程中容易汙染，所以不推薦。另壹種說法為細胞懸液中含有二甲基亞碸（DMSO），DMSO對細胞有壹定的毒副作用，所以須將離心後的液 體前倒凈，且壹定倒幹凈。我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進行復蘇，結果無有異常。
5. 細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養液，而在我的試驗中的經驗總結為培養基越少細胞越容易貼附。
6. 復蘇細胞分裝的問題：試驗中我的經驗總結為復蘇1管細胞壹般可分裝到1-2只培養瓶中，分裝過多，細胞濃度過低，不利於細胞的貼壁。
7. 加培養基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果妳加培養基的太少，那麽DMSO的濃度就會比較大，就會影響 細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小於0.5%的時候對壹般細胞沒有什麽影響，還有壹個說法是1％。所以如果妳的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那麽加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度。