黃瓜和甜瓜的種間雜交長期以來壹直備受關註,因為甜瓜具有黃瓜所缺乏的對某些病原菌的抗性。如果雜交成功,將極大地豐富黃瓜的基因。但是栽培黃瓜和甜瓜與其野生種雜交很難成功。Ondrej等報道(2001)由於受精後的障礙,甜瓜和黃瓜雜種的胚胎只能發育到球形胚階段。由於體細胞的不親和性,甜瓜×黃瓜的體細胞雜種細胞在愈傷組織階段停止分裂(賈爾等,1995)。到目前為止,國內外的研究人員尚未成功地進行黃瓜兩種栽培作物的種間雜交。關於黃瓜栽培作物與野生種的種間雜交,大部分雜交只進行到胚期。除陳等(1997,1998)外,其他關於獲得種間育性F1的報道難以重復。
陳等(1997)首次報道了甜瓜屬的種間雜交。(2n = 2x = 24)和栽培黃瓜獲得成功,並獲得不育後代(2n=19)。為了恢復可育性,在正反交的基礎上,通過染色體加倍和體細胞無性系變異的育性恢復篩選,獲得了具有商業開發前景的新二倍體甜瓜種質(陳等,1998)。新種質命名為海提黃瓜(Chen and Kirkbridge,2000),其基因組為(H和C分別代表海提黃瓜和美洲黃瓜的基因組),染色體數目為2n=4x=38。新種質在露地和溫室中表現出較強的結果能力,每株可結30個左右的果實,同壹節內常結2-3個果實,果實整齊,可壹次性采收,適合於選育腌黃瓜品種。果實細長,基本無核,單果重約50 ~ 100 g,果長約10cm,果型指數3.3。嫩果綠色,除了黃瓜還有壹點檸檬味。蛋白質和礦物質含量分別為0.78%和0.35%,比普通黃瓜分別高出0.62%和0.27%。同時新種質抗白粉病,對南方根結線蟲的抗性介於野生酸黃瓜和栽培黃瓜之間。當雜種與栽培黃瓜作為供體親本回交時,抗性進壹步傳遞到回交世代(陳金峰等,2001)。新品種的光補償點為11.25μE/(m2s),低於此前報道的耐弱光品種長春米慈。經過兩周的弱光處理,新品種葉綠素a和葉綠素b含量增加,葉綠素a/b值大幅下降,耐弱光的形態隸屬值高達0.946,表明新雜交品種具有較強的耐弱光性(錢春濤等,2002)。
表15-5甜瓜栽培種與野生種的種間雜交
陳金峰等(2003)將種間雜交獲得的異源三倍體與栽培黃瓜北京雜交,通過胚挽救獲得兩個2n=15(14C+1H)單體附加系02-17和02-39。前壹株葉掌狀,後壹株深掌狀,果實全白,區別於異源單倍體的掌狀心和黑刺,果形長於異源三倍體黃瓜,接近普通黃瓜。細胞學和RAPD分析表明,野生甜瓜的染色體附著在上述附加系上。
(2)通過種內雜交創新種質。
黃瓜品種間的基因交流比種間的要容易得多。黃瓜的野生品種通過與普通栽培品種雜交是可育的。因此,多年來,國內外育種家壹直致力於將野生品種的強分枝、多結果、高抗某些病蟲害等優良基因轉移到栽培品種中。
迪肯等人(1971)、斯陶博和昆鉑(1985a)都利用野生黃瓜與栽培黃瓜雜交的方式創造了新的種質。野生黃瓜LJ90430比栽培黃瓜植株大,側枝多,種子小,日照短。在北加州秋季氣候條件下,LJ90430品系通常每株可產80個左右成熟果實(Horst及以下,1978)。該菌株已廣泛應用於育種計劃中,並相繼獲得了壹系列優良種質(Staub,1985b,1992;彼得森,1986).
Walters等(1997)利用野生資源LJ90430與栽培種質進行雜交、回交和自交,創新出壹系列抗中國北方和爪谷根結線蟲的種質NC42~NC46。
Simon等(1997)以西雙版納黃瓜為父本,與美國種質SMR18回交,選育出肉色較深的半姊妹系,通過三代姊妹和混合選擇,獲得後代材料104,再繼續姊妹和選擇,獲得胡蘿蔔素含量最高的新種質LOM 404。以美國種質Addis為母本,西雙版納黃瓜為父本進行回交,經過三代姊妹雜交和混合選擇,獲得後代材料101。與104和101雜交,經過5代自交單株選擇和1代混合選擇,獲得新種質EOM 400和EOM402。其胡蘿蔔素含量高達25mg/kg(圖15-10,15-11)。
圖15-10高胡蘿蔔素黃瓜種質創新
圖15-11胡蘿蔔素含量高的黃瓜種質LOM 404的4個成熟果實縱切面。
國內外黃瓜育種家利用自身種質資源,通過品種間雜交,育成了大量抗病、抗逆、優質、高產、成熟度不同的自交系和雌性系,促進了黃瓜品種的雜交優化。比如卓啟勇等人(1988)從1975引進的早龍二代和黑龍中發現了三種類型的植株:全雌株、強雌株和普通株。早代將強雌株的雄花給予全雌株的雌花,晚代結合赤黴素誘導雄性和自花授粉,選育出全雌株率為94.4% ~ 100%的雌性系奧早和黑龍選。之後以敖早和全青為親本,以抗霜黴病性好的全青為輪回親本,連續回交3-4次,獲得全青的優良性狀。然後經過2-3代自交,獲得壹系列雌株率在90%以上的優良雌株和強雌株系,其中奧早75和奧早82為優質、早熟、抗病的雌株系。1995,卓啟勇等人以82個雌性系為母本,大武大瓜為回交親本,雜交回交壹次。經過7代抗病性篩選,選育出抗枯萎病、霜黴病、炭疽病、細菌性角斑病等5種病害的82個雌性系。銀燕和李希祥利用國內外不同類型的黃瓜種質,通過雜交、加性雜交和系統育種,創新出全雌和多雌黃瓜新種質G5224和EF1613。G5224是從國外品種Branex(F1)自交群體中選出的單株與北京甜瓜自交系(S5)雜交,經多代系統選擇獲得優良自交系,再與美國引進的5207雜交,再經多代系統選擇選育而成。該自交系結合了北京多刺、歐洲品種和美洲品種的優點,表現為全雌,早熟,座果率高,果實商品化好,瓜長30cm左右,刺大小和密度適中,顏色深綠,有光澤,無黃條紋,心室小。這些植物耐低溫。苗期經65438±00℃和3000lx光照後,幼苗成活率達92.2%,比對照新泰米茨提高65438±06.4%。抗角斑病、枯萎病、黑星病、白粉病、霜黴病和灰黴病。EF1613是由編號為373/85的國外黃瓜品種與北京黃瓜雜交而成的雜交種。經過四代純化和篩選,獲得壹個優良菌株,然後與東北地方品種8970雜交。經過幾代選育,最終形成了EF 1613品系。該品系生長旺盛,雌花多,座果率較高,主蔓為主,側蔓少,果實商品化好,長30cm左右,瘤體大小和密度適中,顏色深綠,有光澤,無黃色條紋,心室小。植株高度抗黑星病、角斑病、枯萎病和白粉病,中度抗根結線蟲病和霜黴病。利用上述優良種質,培育出第壹代系列雌性和強雌性黃瓜雜交種中農202、中農203和中農208。
常規方法進行種質改良的研究很多,這裏就不贅述了。
3)誘變育種是用物理因子(如X射線、γ射線、紫外線、激光等)處理生物。)或化學因素(如亞硝酸、硫酸二乙酯等。)引起生物體的基因突變。從而在短時間內獲得更優良的誘變育種方法。
陳金峰等(2004)用0.4%秋水仙堿浸泡萌發的黃瓜種子,染色體加倍率達26.7%。同源四倍體與原始二倍體相比,側枝少,葉柄短,葉面積大,花器官大,果實指數低。四倍體花粉的染色性和發芽率顯著下降。
雷春等(2004)通過輻射劑量為200 Gy或300 Gy的C射線授粉結合胚培養,獲得了三種基因型黃瓜的單倍體植株。與正常二倍體植物相比,單倍體植物生長緩慢,花器官異常。同時發現,輻射劑量、親本基因型和授粉組合對坐果率和單倍體產量有壹定影響。
圖15-12黃瓜自交系CHA03210加載前後葉片變化
1.裝載前和裝載後的葉片尺寸2。CHA03210在裝載後部分自封閉(引自於等,2007)。
李家旺等(1997)用23.22 C/kg 60 Co γ射線輻射處理壹些性狀優良的黃瓜自交系種子,在其突變後代群體中篩選出兩個綜合性狀優良的植株。經過三代選育,選育出主要性狀遺傳穩定的品系福M-8。該品系集幾個優良性狀於壹身,以其為親本,與另壹個高代自交系,育成耐低溫弱光雜交新組合:93-黃瓜,適合日光溫室栽培。
圖15-13黃瓜自交系CHA03210加載後突變體植株自交後代果實變異。
陳金峰等(2004)在室溫下分別用0.2%、0.4%、0.8%秋水仙堿水溶液處理黃瓜晉綠4號的幹種子和發芽種子。結果表明,0.4%秋水仙素浸種4h的發芽種子染色體加倍效果最好,加倍率可達26.7%。同源四倍體與原始二倍體相比,側枝少,葉柄短,葉面積大,花器官大,果實指數低。四倍體花粉粒大小不等,平均每朵花中有2.3%的4孔花粉粒;四倍體花粉的染色性和發芽率顯著下降。
空間變異是變異的壹種特殊形式。它利用衛星或高空氣球搭載和運載植物種子等生物樣品,在特殊的空間環境條件(強宇宙射線、高真空、微重力等)作用下,),引起生物染色體畸變,進而誘發生物遺傳變異。經過地面種植和育種試驗,能快速有效地培育出農作物新品種(系)在生產中推廣利用,可廣泛用於各種植物的遺傳改良。該技術也為黃瓜種質創新開辟了壹條新途徑。於等(2007)利用衛星搭載黃瓜自交系材料。通過地面種植和觀察,當代植物出現了葉片大小和株型的自封頂變異。自交分離後,果實大小、果形指數、雌花節率和每節雌花數變化較大。純化後獲得超小型黃瓜自交系CHA03-10-2-2。自交系長8cm左右,雌花節率99.5%,性狀穩定,可直接用於培育黃瓜新品種。
(四)利用細胞工程和基因工程創新種質
細胞工程是應用細胞生物學和分子生物學的方法,借助工程實驗方法或技術,在細胞水平上研究和改造生物遺傳特征和生物學特性,從而獲得特定細胞、細胞產物或新物體的相關理論和技術方法的學科。廣義的細胞工程包括生物組織、器官和細胞的所有體外操作和培養技術,狹義的細胞工程是指細胞融合和細胞培養技術。植物細胞工程包括:植物組織和器官培養技術、細胞培養技術、原生質體融合與培養技術、亞細胞操作技術等。目前,細胞工程技術在黃瓜種質創新中的應用主要集中在大孢子培養、原生質體培養和體細胞融合。
據杜勝利(2004)介紹,天津科潤黃瓜研究所“利用分子標記和單倍體技術創造黃瓜育種新材料”項目通過了天津市科委組織的技術鑒定。本項目通過對黃瓜雌核發育的發育機理、黃瓜雌核發育離體培養體系、黃瓜染色體倍性鑒定和加倍技術的研究,建立了壹套高效穩定的黃瓜未受精子房培養技術體系,再生頻率達到25%。研究並建立了壹種簡單、快速、有效的倍性鑒定方法,篩選出壹種誘導黃瓜單倍體和二倍體染色體的有效方法,加倍頻率達到16.9%。據孫日飛(2005)介紹,黃瓜大孢子培養的最佳時間是開花前2-3天,以Miller為基本培養基,AD或ADS為細胞分裂素,蔗糖為首選糖源。將無菌材料橫切或縱切後,接種於誘導培養基三角瓶中,然後轉入培養室培養:最好在25℃黑暗培養7天,然後移至14h/10h(光照/黑暗)恒溫。這種技術基本成熟,植物已經被這種技術培育出來了。
來自子葉、真葉和胚胎懸浮培養細胞的黃瓜原生質體培養已經成功(陸德陽等,1984;劉等,1991,賈等,1985,1988;Punja等人,1990),但再生植株相對困難。
為了獲得再生植株,張興國等人(1998a)研究了黃瓜原生質體的分離和再生條件。結果表明,在7日齡黃瓜子葉和真葉中添加15 ~ 17d纖維素酶、0.5%分離酶和0.25 ~ 0.30 mol/L甘露醇。成都二早子黃瓜真葉原生質體愈傷組織培養的胚狀體和子葉原生質體愈傷組織誘導的不定芽均已成苗。
張興國等(1998b)將黃瓜子葉原生質體在1.0毫克/升BA和0.05毫克/升NAA的MS固體培養基上再生綠色苗,然後生根成為完整植株。10μ g/ml羅丹明6G(R6G)處理15min或1.5mmol/l碘乙酸(IOA)處理10min能有效抑制黃瓜原生質體分裂。分別被R6G和IOA滅活的原生質體經PEG和高鈣高pH法融合後可恢復分裂和生長。從四個黃瓜種內組合獲得愈傷組織。部分愈傷組織分化出根,部分愈傷組織經酯酶同工酶分析鑒定為體細胞雜種。
基因工程技術在黃瓜種質創新中的應用也取得了壹定的進展。國內報道了利用外源DNA介導法改良黃瓜種質的試驗。鄧力平等(1995)報道以抗霜黴病的黃瓜金燕4號為供體,以高產感病黃瓜長春密刺為受體。人工授粉12 ~ 24h後,用顯微註射法將外源DNA通過柱頭註入受體子房,從而導入外源基因,獲得穩定的突變新品系CJ90-40。
鄒(2004)將冷誘導基因cor15a和轉錄因子CBF3同時導入黃瓜基因組,並通過了植物基因組DNA的PCR檢測和Southern雜交檢測。PCR結果顯示,4株植物攜帶cor15a基因,3株植物攜帶CBF3基因,其中只有2株攜帶雙基因。轉基因植株的Southern雜交結果表明,在兩個雙表達盒轉基因植株中,1有2個拷貝的目的基因,另壹個有1個拷貝,證明目的基因已經導入黃瓜基因組。