普拉多博物館的藏品大約有五千幅素描、兩千幅版畫、壹千種硬幣及獎章、兩千種裝飾品及其他藝術品，700多件雕塑作品，但最主要的藏品是大師們的繪畫作品，大約有8600幅，使普拉多博物館躋身於世界著名博物館行列之中。普拉多博物館是世界上保有羅德裏格斯德·席爾瓦·委拉斯開茲·叠戈和弗朗西斯科·何塞·德·戈雅·盧西恩特斯 的作品最多的博物館，也是藏有荷蘭畫家希羅尼穆斯·波希的作品最多的博物館，因為原西班牙國王腓力二世最欣賞他的畫，大力收藏的結果。同時藏有拉斐爾、米開朗基羅、提香·韋切利奧、彼得·保羅·魯本斯、倫勃朗·哈爾曼松·凡·萊因、阿爾布雷希特·丟勒、桑德羅·波提切利、保羅·委羅內塞等大師的作品，以及其他壹些文藝復興時期意大利和希臘畫家的作品。
西班牙王卡洛斯壹世（1517—1556在位。即德皇查理五世）繼承祖母天主教徒伊莎貝爾的傳統，廣為搜羅佛蘭德斯及意大利繪畫作品。當時正值意大利文藝復興，提香引得查理壹世的贊賞，曾受命為他畫肖像。其子腓力二世（1556—1598在位）偏愛神話與宗教題材。現存普拉多的幾幅蒂齊亞諾的維納斯，全由他羅致。但他卻不欣賞埃爾·格雷科的天才。腓力三世（1598—1621在位）及其子腓力四世（1621—1665在位）則都推崇魯本斯及其他17世紀佛蘭德斯畫家。為此，普拉多今藏魯本斯作品達80件之多，安東尼·凡·戴克26件、雅各布·喬登斯10件、滕尼爾斯（Teniers）51件，以及佛蘭德斯畫派的肖像、宗教、神話、風景、靜物、風俗等各類作品，加上早先皇室收集的羅吉爾·凡·德爾·維登、坎平（Camping）、老迪裏克·鮑茨、雅克·路易·大衛、梅齊斯（Metsys）、帕蒂尼爾（Patinir）、希羅尼穆斯·波希、勃魯蓋爾家族等名家手跡，從而成為世界上收藏佛蘭德斯畫派作品最豐富、最重要的博物館之壹。
哈布斯堡王朝最後壹位國王查理二世（1665—1700在位）註重意大利巴羅克大師盧卡·焦爾達諾（Luca Giordano）的藝術，收其作品竟達百幅之數。在兩個世紀中的皇家西班牙藝術收藏更是蔚為可觀。許多藝術家曾為宮廷服務，或畫像，或記事。其中，委拉斯開茲便是突出壹例。
在意大利繪畫收藏方面，早在卡洛斯壹世時即搜羅了安傑利科、曼泰尼亞、拉斐爾、科雷喬、薩爾托（Sarto）等人作品，後來各處皇家宮室又大量收入蒂齊亞諾（普拉多現有其作品近40幅）、焦爾焦內（Giorgione）、洛托（Totto）、皮翁博（Piombo）、韋羅內塞（Veronese）、丁托萊托、帕爾馬（Palma）、巴薩諾父子（Bassano）等巴羅克巨匠之作，以及卡拉瓦喬、雷尼、卡拉奇兄弟、阿爾巴尼（Albani）、多梅尼基諾（Domeniehino）、科爾托納（C rtona）等許多藝術家的佳作。
1700年，波旁家族繼哈布斯堡王朝登上西班牙王位。法國路易十四之孫菲利普五世（1700—1746在位）在成為西班牙國王之後，帶來為數眾多的法國17、18世紀作品。除古典大師克洛德·洛蘭和尼古拉·普桑之處，還有裏戈、拉爾吉利埃爾、朗克、旺·洛等肖像大家，以瓦托為代表的行樂圖派，以及其他風景、神話、裝飾等各類畫家的作品，不斷湧來。18世紀，還有不少意大利及法國畫家到西班牙宮廷為菲利普五世、斐迪南六世（1746—1759在位）和查理三世（1759—1788在位）服務。於是，在皇室收藏中，蒂耶波洛父子（Tiepolo）、阿米戈尼（Amigoni）、賈昆托（Giaquinto）、索利梅納（Solimena）、巴托尼（Batoni）等人之作大增。甚至德國畫家安東·拉斐爾·門斯也以畫筆為查理三世效勞，畫了許多肖像、宗教畫和壁畫。
查理四世（1788—1808在位）統制下的西班牙雖因法國入侵而備嘗艱辛，但仍有相當數量的藝術品為皇家購入。反抗拿破侖的持久而殘酷的獨立戰爭於1813—1814年結束，斐迪南七世繼位，他成為普拉多的締造者。
在普拉多收藏中，最主要的部分畢竟是西班牙畫派浩瀚的、具有世界意義的作品。從中世紀直至20世紀末的整個西班牙藝術發展史，可從普拉多的收藏得到完美的反映。這壹無與倫比的珍藏，體現西班牙繪畫在思考、創作、感受、觀察、繪制等各個方面的獨特方式。
在前幾個世紀中尚湮沒無聞的中世紀繪畫，於20世紀進入了普拉多。從貝爾蘭加的聖包德洛教堂和馬德魯埃洛的聖十字隱修院等處移來的精美羅曼壁畫，到許多傑出哥特祭壇畫，反映了12至15世紀之聞伊比利亞半島上獨特的文化。眾多佚名或知名的大師代表著羅曼式、線式哥特式或法蘭西哥特式、14世紀潮流、國際哥特式或西班牙—佛蘭德斯風格——這是來自低地國家的表現程式與西班牙畫派傳統精神的融合。從費爾南多·加列戈（Fernando Gallego）至佩德羅·貝魯格特（Pedro Berruguete）這壹階段，標誌著早期文藝復興的到來。
達·芬奇的藝術在亞涅斯·德·拉·阿爾梅迪亞（Yanez de la Almedia）的作品中得到反響。至於16世紀意大利的光輝，則反映在胡安·德·華內斯（Juan de Juanes ）以及巴倫西亞派和托萊多派的創作中。這兩派已轉向樣式主義；稍後的路易斯·德·莫拉萊斯（Luis de Morales ）和埃爾·格雷科卓然不群的肖像及宗教作品，尤其揭示了這壹發展。普拉多擁有34幅精彩的埃爾·格雷科作品。與此同時，腓力二世的壹些畫師如桑切斯·科埃略（Sanchez Coello）、潘托 哈·德·拉·克魯斯（Pantoja de la Cruz）等人，也都是觀察敏銳、風格莊重的肖像高手。
西班牙的巴羅克藝術，由塞維利亞派 、巴倫西亞派和馬德裏派的畫家宣告。普拉多收藏他們作品的數量極為驚人：貝拉斯克斯50幅、蘇爾瓦蘭（Zurbaran，舊譯蘇巴朗）22幅、裏瓦爾塔（Ribalta）6幅、裏韋拉（Ribera）50幅、卡諾（Cano）10幅、穆裏略（Murillo）40幅、巴爾德斯·萊亞爾（Valdes Leal ）6幅、卡雷尼奧·德·米蘭達（Carreno de Miranda ）10幅、克勞迪奧·科埃略（Claudio Coello）10幅，以及其他諸如帕切科（Pacheco）、兩位埃雷拉斯（Herreras）、安托利內斯（Antolinez）、塞雷索（Cerezo）、埃斯卡蘭特（Escalante）、佩雷達（Pereda）、阿雷利亞諾（Arellano）、範·德爾·阿曼（Van der Hamen ）、桑切斯·科坦（Sanchez Cotan ）、卡杜喬（Carducho）、卡赫斯（Caxes）、卡斯特洛（Castelo ）、馬索（Mazo）、阿圭羅（Aguero）、裏奇（Ricci）等藝術家的肖像畫、歷史畫、宗教畫、靜物畫、風景畫和各類裝飾作品，數不勝數。這些畫家為西班牙藝術動人心魄的“黃金世紀”做出了重大貢獻。
18世紀，由於波旁家族取代哈布斯堡王朝，致使壹些畫家把目光從未來轉向過去。帕洛米諾（Palomino）、梅倫德斯（Melendez）以及另壹些較為次要的畫家即是如此。然而，靜物大師梅倫德斯和羅可可藝術代表帕雷特（Paret）的藝術所開創的舞臺，由巴耶烏（Bayeu）、馬埃利亞（Maella）、卡尼塞羅（Carnicero）、卡馬龍（Camaron）、卡列哈（Calleja）、卡斯蒂洛（Castilo）、阿吉雷（Aguirre）等人如同眾星捧月般擁簇著弗朗西斯科·德·戈雅，演得有聲有色。普拉多所藏戈雅的油畫***140幅，素描及版畫作品尚不在此數之內。這些戈雅作品為歐洲繪畫新的審美趣味開辟了道路，其影響長達壹個多世紀。
普拉多19世紀西班牙繪畫收藏同樣是豐富多彩：從宮廷肖像畫師到浪漫派，從豪放、怪誕的戈雅琶細膩、忠實描繪歷史的畫家，以後又是西班牙的印象派和表現派，直至當代諸多藝術運動的既是倡導者又是集大成者的帕勃洛·魯伊斯·畢加索（Pablo Ruiz Picasso），他們都有許多作品在館內陳列。
普拉多收藏另外壹些國家的作品，數量雖然不多，但質量卻很高。在過去幾個世紀中，由於政治上和藝術上的種種原因，荷蘭和大不列顛王國的繪畫對於西班牙皇室來說，收集頗為困難。盡管如此，普拉多畢竟還能展出荷蘭畫派的倫勃朗、泰爾·博爾赫（Ter Borch ）、凡·戈伊恩（Van Goyen）以及從事各種題材的荷蘭小畫派的作品，英國畫派的蓋恩斯伯勒（Gainsborough，舊譯庚斯博羅）、雷諾茲、羅姆尼（Romney）、勞倫斯（Lawrence）以及其他著名畫家的作品。至於德國畫派，雖然氣質迥異，但是普拉多尚能以擁有丟勒、巴爾東·格林（Baldung Grien ）、老盧卡斯·克拉納赫、亞當·埃爾斯海默、安東·拉斐爾·門斯等名家的手跡自豪。安東·拉斐爾·門斯的作品在普拉多尤其豐富。
為把普拉多辦得更富於教育意義、更有觀賞價值，20世紀以來對各類現代作品的收集所作的努力是驚人的，雖然其成效尚不能與過去的收藏相提並論，但是，盡力克服經濟上的困難而使普拉多成為盡可能包羅無遺而又均衡的博物館的意圖是顯而易見的。正因為如此，普拉多過去曾是而且將來仍是壹切美術愛好者之家。過去，普拉多曾幫助許多各種傾向的現代藝術家從蒂齊亞諾、埃爾·格雷科、委拉斯凱茲、穆裏略、魯本斯、戈雅等大師在作品中學到許多東西；將來，它仍是各色人等進行觀摩學習或品味享受的輝煌璀璨的長廊。普拉多的稀世珍藏以及由此形成濃厚的文化氛圍，布滿它的各個展廳，無論是誰，都會在這裏得到收益和陶醉。