哈佛大學神經學家利文斯通博士表示，蒙娜麗莎的微笑閃爍不定，這與人類的視覺系統有關，而不是畫中人的神秘表情。利文斯通博士是視覺神經活動方面的權威，主要研究眼睛和大腦對不同對比度和明暗的反應。利文斯通說:“微笑在閃爍，因為觀看者改變了眼睛的位置。”她說，人眼有兩個不同的部分接收圖像。中央部分(也就是視網膜上的淺窩)負責區分顏色和仔細標記。註意淺坑外圍的黑白、動作和陰影。根據利文斯通的說法，當人們看壹張臉時，他們的大部分目光都集中在對方的眼睛上。如果人的中央視覺放在蒙娜麗莎的眼睛裏，那麽不太準確的周邊視覺就會落在她的嘴上。因為周邊視覺不註重細微差別，無形中突出了顴骨的陰影。這樣，笑容的弧度就更大了。但是，當眼睛直視蒙娜麗莎的嘴時，中央視覺不會看到陰影。利文斯通說:“如果妳看她的嘴，妳永遠不會捕捉到她的微笑。”蒙娜麗莎的微笑若隱若現，因為人們的目光在不斷轉移。利文斯通指出，如果妳想臨摹蒙娜麗莎，那麽在描述嘴巴的時候，妳應該把目光移開。
1993，加拿大藝術史學家蘇珊·吉爾(Susan Gill)發表了壹項令人震驚的研究成果。她說，吸引無數觀眾的蒙娜麗莎的嘴唇，是男人的光背。這個論點既新穎又荒謬，但論據有力。達芬奇，畫家、雕塑家、建築師、工程師、科學家，是壹個“極客”。他喜歡穿著粉紅色的外套，毫無顧忌地把胡子塗上五顏六色的顏色，還經常聲稱自己解剖過30多具屍體。他還是左撇子，習慣從右向左倒著寫。其他人必須用鏡子來閱讀他寫的東西。因此，借助鏡子也是觀眾讀圖的壹種方式。旋轉90度後，鏡中蒙娜麗莎抿著的嘴唇，恰好是壹個線條清晰的壯漢的背影，以及左臂和肘角；況且，表現人體之美，呼喚人性的覺醒，既是大師的人生哲學，也是他的藝術觀。
的確，人們從不同的角度，在不同的光線下欣賞這幅畫，會得到不同的感受。那笑容時而溫柔，時而安詳嚴肅，時而略帶傷感，時而又有幾分諷刺和調侃。神秘的微笑揭示了人物神秘的精神活動。
幾百年來，“微笑”的新解釋層出不窮。比如笑起來不露白牙是因為原型優雅漂亮但不善言辭；原型因為心愛的女兒去世，抑郁不樂，難掩悲傷。更有甚者，蒙娜麗莎被推下了貴婦的寶座，原型被貶為妓女，於是帶著嘲笑和調侃的笑容。
美國馬裏蘭州的約瑟夫·鮑考斯基博士說:“《蒙娜麗莎》根本沒有笑。她的面部表情典型地表明，她想隱瞞自己沒有門牙。”
法國裏昂的腦外科醫生讓·雅克·康德特博士認為蒙娜麗莎剛剛中風。看，她半邊臉的肌肉松弛，臉歪了，所以看起來在笑。
英國醫生肯尼斯·基友博士認為蒙娜麗莎懷孕了。他的依據是，她的臉上露出滿意的表情，皮膚鮮嫩，雙手交叉放在腹部。性學家推測，蒙娜麗莎剛剛經歷了高潮，所以她露出了壹個讓世界著迷的微笑。
還有壹種近乎無厘頭的說法:她的表情看起來像是吃了苯丙氨酸，這是吃了巧克力後體內產生的壹種快感激素。很少有人相信這種說法，因為那時候還沒有巧克力。