實驗原則
細菌不能直接利用大分子澱粉、蛋白質和脂肪，必須通過產生的胞外酶，如澱粉酶、蛋白酶和脂肪酶來分解大分子物質。胞外酶可以分泌並擴散到細胞外，將物質分解成小單元，如糖、氨基酸、甘油和脂肪酸。這些小單位可以被細菌吸收利用。水解過程可以通過底物的變化來證明。例如，在細菌水解澱粉的區域，通過碘測定不再產生藍色。水解明膠可以觀察到明膠液化；脂肪水解後產生的脂肪酸改變了培養基的pH值，中性紅指示劑使培養基由淺紅色變為深紅色。
(2)實驗方法
澱粉培養基溶解後，冷卻至45℃左右，無菌操作制成平板。
取18-24h純培養物點於平板上。每個培養皿可以接種3-5個菌株，並在合適的溫度下培養2-4d。形成菌落後，將盧戈氏碘溶液滴在平板上，使平板變成藍色。如果菌落周圍有無色透明的圓圈，說明澱粉已經水解，實驗為陽性，否則為陰性。透明圓圈的大小通常表明澱粉被水解。
(3)實驗試劑的準備
肉湯蛋白腖瓊脂的成分:蛋白腖10g，牛肉醬3g，氯化鈉5g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL，pH7.2。
澱粉培養基的制備:肉湯蛋白腖瓊脂中加入0.2%可溶性澱粉，調節pH至7.6，分裝於三角瓶中，121℃ 20min℃滅菌20min。
盧戈氏碘溶液:碘片1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml。先將碘化鉀溶於少量水中，再將碘片溶於碘化鉀溶液中，混勻，定容。
糖發酵試驗
實驗原則
單糖發酵是在蛋白腖水培養基中分別加入葡萄糖、乳糖或麥芽糖，使其終濃度為0.75-1%，加入壹定量的酚紅指示劑和小倒管制成單糖發酵管，接種細菌，37℃培養18-24小時。如果糖能分解產生酸，酚紅指示劑會從紅色變成黃色，如果甲酸能分解，會形成CO2和H2等氣體。沒有分解，指示劑不會變色。
(2)實驗材料
1.菌種:大腸桿菌、傷寒桿菌65438+瓊脂斜面培養08-24小時。
2.培養基:葡萄糖發酵管、乳糖發酵管等。
(3)實驗方法
1.按照液體接種法，將傷寒沙門氏菌和大腸桿菌分別接種到葡萄糖和乳糖發酵管中。
2.在37℃下孵育18-24小時。
3.觀察結果:由於某些細菌能分解某些糖類產生酸，培養基中的pH值下降到7.0以下，在酚紅指示劑的顯示下，培養基的顏色由紅色變為黃色。產酸者用“+”號表示，如果同時產氣，培養基中的小倒管出現氣泡，既是產酸又是產氣，用“？”表示如果不分解，指示劑不會變色，用“-”號表示。
(4)實驗結果
傷寒桿菌大腸桿菌
葡萄糖+
牛奶糖-
(5)實驗試劑的準備
1.單糖發酵管的制備:成分:蛋白腖水培養基100ml，0.2%酚紅1ml，所需糖(葡萄糖或乳糖)0.75-1g。
方法:
(1)將上述成分溶解，混勻後放入有倒置玻璃管的小試管中，每管約2ml，塞緊。
(2)將倒置的小試管排空，滅菌(8-10磅，20-30分鐘)並儲存以備後用。
用途:用於單糖發酵試驗。
2.0.2%酚紅的制備方法
酚紅0.2g，0.lmol/l氫氧化鈉8ml，蒸餾水92ml。
將酚紅加入研缽中，用0.lmol/LNaOH,慢慢研磨，用蒸餾水補足。如果需要長時間保存，可以高壓滅菌保存備用。
三甲基紅試驗
實驗原則
有些細菌，如大腸桿菌，分解葡萄糖產生丙酮酸，然後分解成甲酸、乙酸、乳酸等。，使培養基的pH值降至4.5以下，甲基紅的指示劑為紅色，為陽性反應；如果產酸量低或產生的酸進壹步轉化為醇、醛、氣體和水，培養基的pH仍在pH 6.2以上，甲基紅的指示劑為黃色，為陰性反應。
(2)實驗材料
1.細菌:大腸桿菌，產氣桿菌18-24h瓊脂斜面培養。
2.培養基:葡萄糖蛋白腖水培養基。
3.試劑:甲基紅試劑。
(3)實驗方法
1.大腸桿菌和產氣桿菌分別接種於兩種葡萄糖蛋白腖水培養基中。
2.在37℃下放置2-3天，取出後分別滴入2-3滴甲基紅試劑，混勻，觀察結果。
(4)實驗結果
大腸桿菌:+，產氣桿菌:-。
(5)實驗試劑的準備
甲基紅試劑的制備
甲基紅0.04克，95%酒精60毫升，蒸餾水40毫升。
先將甲基紅溶解在酒精中，然後加入蒸餾水，混合並搖勻。
2.葡萄糖蛋白腖水培養
配料:蛋白腖5g葡萄糖5g。
方法:
(1)將上述成分溶於蒸餾水中。
(2)調節pH值至7.6，用濾紙過濾除去殘渣。
(3)分裝試管，每支約3-4ml，滅菌備用。
用途:用於甲基紅和V-P測試。
吲哚生產試驗
實驗原則
有些細菌，如大腸桿菌和變形桿菌，有色氨酸酶，能在蛋白腖水介質中分解色氨酸生成靛藍基質(無色吲哚)，再與埃利希試劑(對二甲氨基苯甲醛)反應生成紅色化合物——玫瑰吲哚，為陽性反應。
(2)實驗材料
1.菌種:大腸桿菌、傷寒桿菌65438+瓊脂斜面培養08-24小時。
2.培養基:蛋白腖水培養基。
3.試劑，埃利希試劑(對二甲氨基苯甲醛)
(3)實驗方法
1.大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌分別接種於兩種蛋白腖水培養基中。
2.37℃培養2-3天後，沿各管壁向培養液表面加入0.5-1毫升埃利希試劑，1-2分鐘後觀察結果:界面處的玫瑰色環為吲哚試驗陽性，無紅色環為陰性。
(4)實驗結果
大腸桿菌:+；傷寒沙門氏菌:-。
(5)實驗試劑的準備
蛋白腖水培養基的制備
成分:蛋白腖10克氯化鈉5克蒸餾水1000毫升。
方法:
(1)首先將蛋白腖和氯化鈉與少量蒸餾水混合，然後加入足夠的蒸餾水。
(2)調節pH值至7.6，用濾紙過濾。
(3)分裝試管，每管約3-4ml，塞緊滅菌備用。
2.埃利希試劑的制備
對二甲氨基苯甲醛4g
95%酒精380毫升
80毫升濃硫酸或濃鹽酸
三種成分混合，瓶口要緊，避免揮發。
硝酸鹽還原試驗
(壹)硝酸鹽還原試驗原理:
硝酸鹽還原反應包括兩個過程:壹是在合成過程中，硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽和氨，然後在細胞內由氨還原為氨基酸等含氮化合物；二是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧氣作為呼吸酶系中的末端受體，可使硝酸鹽還原菌從硝酸鹽中獲得氧氣，形成亞硝酸鹽等還原產物。而硝酸鹽還原的過程因細菌而異，有的細菌只是將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸桿菌。有些細菌能將其還原為亞硝酸鹽和離子銨；有些細菌能把硝酸鹽或亞硝酸鹽還原成氮，如假單胞菌。硝酸鹽還原試驗是測定還原過程中產生的亞硝酸鹽。
(2)培養基:
硝酸鹽培養基。
(3)試劑:
溶液A(對氨基苯磺酸0.8g+5mol/L乙酸100ml)；B液(α-萘胺0.5g+5mol/L醋酸100ml)。
(4)方法:
將試驗菌接種於硝酸鹽培養基中，35℃培養65438±0 ~ 4d。將等量(約0.1毫升)的溶液A和溶液B混合後，加入培養基中，立即觀察結果。
(5)結果:
紅色是陽性。如果加試劑後沒有顯色反應，可能是:①硝酸鹽未被還原，試驗為陰性；②硝酸鹽被還原成氨、氮等其他產物，導致假陰性結果。這時候試管裏要加壹點鋅粉。如果顯示為紅色，則表明測試確實為陰性。如果仍不產生紅色，則表明測試為假陰性。
如果想檢查是否產氮，可以在培養基管中加壹個小的倒置管。如果產生氣泡，就會產生氮氣。
(6)應用:
該實驗廣泛應用於細菌鑒定。腸桿菌科細菌能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；假單胞菌如銅綠假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌能產生氮；壹些厭氧菌，如維氏弧菌，也呈陽性。
(7)實驗試劑的準備
硝酸鹽液體培養基
蛋白腖5.0g，硝酸鉀0.2g，蒸餾水1000 mL，pH7.4，每管4-5ml，121℃滅菌15-20min。
六氨生產實驗(尿素分解實驗)
實驗原則
有些細菌，如變形桿菌，有脲酶，能分解尿素產生氨。氨溶於水，變成氫氧化銨，使培養基呈堿性，呈紅色，為陽性。
(2)實驗材料
1.菌種:變形桿菌、傷寒桿菌65438+瓊脂斜面培養08-24小時。
2.培養基:尿素培養基。
(3)實驗方法
1.用斜面接種法將變形桿菌和鼠傷寒沙門氏菌分別接種在兩種尿素斜面培養基上。
2.在37℃培養18-24小時。
3.取出觀察結果，培養基變紅，即尿素分解試驗陽性，反之，尿素分解試驗陰性。
(4)實驗結果
Proteus:+；傷寒沙門氏菌:-。
(5)實驗試劑的準備
尿素培養基的制備
配料:蛋白腖1g，氯化鈉5g，葡萄糖1g，蒸餾水900ml，瓊脂15-20g，0.1%酚紅12ml，20%尿素水溶液(無菌)100ml。
方法:(1)除尿素、瓊脂、酚紅外外，其余成分溶於水，加熱溶解，調pH至6.8-6.9。
(2)加入瓊脂和酚紅，在115℃滅菌10分鐘。
(3)冷卻至60℃後，加入無菌尿素溶液，搖勻。
(4)分裝試管(無菌)，每管3-4ml，設為斜面備用。
說明:(1)尿素不耐熱，不能長時間保存，只能過濾滅菌。
2.無菌尿素溶液的配制:稱取20g尿素，混於100ml蒸餾水中，搖勻，用G6過濾器過濾滅菌，達到無菌的目的。
七乙酸鹽利用試驗
實驗原則
該實驗用於測試細菌利用檸檬酸鹽的能力。細菌利用檸檬酸鹽的能力不同。例如，各種腸道細菌可以利用檸檬酸鹽作為碳源，而大腸桿菌則不能。因此，能否利用檸檬酸鹽是壹個顯著特征。當培養基中含有檸檬酸鈉時，如果檸檬酸分解為CO2，培養基中的遊離鈉離子呈堿性，使培養基中出現酚紅指示劑(pH6.8-8.4，黃色→紅色)。
(2)材料
檸檬酸鈉2g，K2HPO4 1g，NH3H2PO4 1g，NaCl 5g，mgso 4 0.2g，瓊脂1.5 2g，1%溴百裏酚藍(酒精溶液)或0.04%酚紅10ml，水65438+。
將上述成分加熱溶解後，調節pH至PH6.8，然後加入酚紅指示劑，搖勻，用脫脂棉過濾。制成黃綠色後，分裝於試管中，於. 121℃滅菌20min，制成斜面。
(三)實驗內容
1.將試驗菌接種在斜面上，在適宜的溫度下培養3-5天。
2.如果細菌能利用檸檬酸鹽，就能在這個斜面上生長，把培養基從淡粉色變成玫瑰紅，這就是陽性；顏色相同的為陰性。
八油水解試驗
(1)原則
有些細菌能分泌脂肪酶(胞外酶)，能把培養基中的脂肪水解成甘油和脂肪酸。產生的脂肪酸可以通過事先在油培養基中添加中性紅來指示[指示範圍:pH6.8(紅色)~ ~pH8.0(黃色)]。當細菌分解脂肪產生脂肪酸時，培養基中就會出現紅點。
(2)實驗內容
1.將裝有油培養基的錐形瓶在沸水浴中融化，取出充分搖勻(使油均勻分布)，然後倒入培養皿中，凝固後制成平板。
2.將盤子翻過來，讓底部盤子的背面朝上，用記號筆在背面玻璃上畫出壹半。壹半用於接種金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌，另壹半用於接種大腸桿菌或產氣腸桿菌等實驗菌。接種時，用接種環在平板兩面標記少量細菌。
3.將接種板倒置於37℃培養箱中培養24小時。
4.觀察結果時，註意平板上細菌生長的地方。如果出現紅點，說明脂肪已經水解，這是陽性反應。
(3)培養基的制備
油脂培養基:蛋白腖10g，牛肉醬5g，氯化鈉5g，芝麻油或花生油10g，中性紅(1.6%水溶液)約0.1ml，瓊脂15-20g，蒸餾水1000ml，pH 7.2。
九接觸酶試驗
實驗原則
該實驗用於測試細菌是否具有接觸酶活性。接觸酶又稱過氧化氫酶，是壹種以血紅素為輔助基團的酶，能將過氧化氫分解為水和氧氣。壹般需氧菌和兼性厭氧菌(部分鏈球菌和乳酸桿菌除外)都能產生接觸酶，厭氧菌不產生，這是用來區分需氧菌和厭氧菌的方法之壹。
(2)材料
牛肉膏，蛋白腖瓊脂培養基，3%過氧化氫。
牛肉膏和蛋白腖瓊脂培養基:牛肉膏0.3g，蛋白腖1g，氯化鈉0.5g，瓊脂2g，自來水100mL，pH 7.0~7.2，滅菌。
(三)實驗內容
1.接種試驗菌，在適宜溫度下培養18-24小時。
2.在菌苔斜面上(或塗有菌苔的載玻片上)滴3%雙氧水，靜置1-3分鐘。如果產生了泡沫，那就是正的。如果不產生氣泡，則為負值。
(4)應用
在革蘭氏陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌都產生過氧化氫酶，而鏈球菌是陰性的，因此該測試通常用於革蘭氏陽性球菌的初步分組。
十克染色
實驗原則
革蘭氏染色是細菌學中廣泛使用的壹種差異染色方法。結晶紫和碘溶液媒染初步染色後，在細胞壁中形成不溶於水的結晶紫和碘的復合物。革蘭氏陽性菌由於細胞壁厚，肽聚糖網絡多層，交聯緊密，在乙醇或丙酮脫色時會因失水而使網格縮小。另外，它不含脂類，所以乙醇處理不會有空隙，所以結晶紫和碘的絡合物可以牢固地留下。革蘭氏陰性菌由於細胞壁薄，外膜脂質含量高，肽聚糖層薄，交聯差，遇到脫色劑後迅速溶解脂基外膜，薄而疏松的肽聚糖網絡不能阻止結晶紫與碘的復合物的溶解，所以用乙醇脫色後仍保持無色，再用沙黃等紅色染料復染後革蘭氏陰性菌變紅。
(2)實驗方法
革蘭氏染色壹般包括壹次染色、媒染、脫色、二次染色四個步驟。具體操作方法如下:
1.塗片固定。
2.草酸銨結晶紫染色65438±0分鐘。
3.用自來水沖洗。
4.用碘溶液覆蓋，染色約65438±0分鐘。
5.用水沖洗，用吸水紙吸水。
6.加入幾滴95%的酒精，輕輕搖動脫色，20秒鐘後用清水沖洗吸收水分。
7.用梁色液(稀釋)染色2分鐘後，用自來水沖洗，晾幹，顯微鏡檢查。
【染色結果】:革蘭氏陽性反應菌均為紫色，陰性反應菌均為紅色。
(3)應用
其重要的臨床意義在於:1。細菌的鑒定2。藥物的選擇。與致病性有關:革蘭氏陽性菌可產生外毒素，革蘭氏陰性菌可產生內毒素，兩者致病作用不同。