蛋白質的分離方法有哪些，各有什麽特點？

1.根據分子大小不同進行分離純化蛋白質是壹種大分子物質，不同蛋白質的分子大小不同，所以可以用壹些簡單的方法將蛋白質從小分子物質中分離出來。蛋白質混合物也被分離。根據蛋白質分子大小的不同，分離方法主要有透析法、超濾法、離心法和凝膠過濾法。透析和超濾是分離蛋白質的常用方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中，然後浸入透析液中進行分離。超濾是利用離心力或壓力迫使水和其他小分子通過半透膜。蛋白質被截留在半透膜上。這兩種方法可以將蛋白質大分子與主要由無機鹽組成的小分子分離開來。它們通常與鹽析和鹽析結合使用。鹽析或鹽析後，這兩種方法都可以用來去除引入的無機鹽。因為超濾時濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞，導致超濾速度變慢。截止物質的分子量越來越小。因此，在使用超濾法時，需要選擇合適的濾膜或切向流過濾，以獲得更理想的效果。離心也是壹種分離蛋白質的方法，通常與其他方法結合使用。當蛋白質和雜質的溶解度不同時，可以通過離心分離。比如在米渣提取蛋白質的實驗中，加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後，通過離心初步分離有用物質和分解的雜質[3]。在具有密度梯度的介質中離心蛋白質的方法稱為密度梯度(區帶離心)。常用的密度梯度包括蔗糖梯度、多糖梯度和其他合成材料的密度梯度。可以根據所需的密度和滲透壓範圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心已被用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴胞晶體蛋白。所得產品純度高，但收率低。姜晨等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果，利用溴化鈉密度梯度，獲得了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾，也稱為凝膠滲透色譜，是根據蛋白質分子大小的不同來分離蛋白質的最有效的方法之壹。凝膠過濾的原理是，當不同的蛋白質流過凝膠層析柱時，大於凝膠珠孔徑的分子無法進入凝膠珠內部的網狀結構，而是被排除在凝膠珠之外。相反，使用溶劑時，孔徑小於凝膠珠的分子會流出色譜柱。目前，常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白的純化過程中，采用凝膠過濾法可以獲得良好的效果。純度鑒定證明該產品為單壹均勻的糖蛋白，分子量約為32 kDa，其成分為多糖∶蛋白質(88∶12)，多糖為甘露糖[1]。凝膠過濾也用於去除抗凝蛋白提取過程中的大部分雜質和小分子[7]。2.根據溶解度的不同，影響蛋白質溶解度的外界條件有很多。例如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度。然而，在相同的條件下，不同的蛋白質由於分子結構不同而具有不同的溶解性。根據蛋白質分子結構的特點，通過適當改變外界條件，可以選擇性地控制蛋白質混合物中某壹組分的溶解度。為了達到分離純化蛋白質的目的，常用的方法有等電點沈澱和調節pH、蛋白質的鹽溶解和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠束萃取法等。等電點沈澱和pH調節是最常用的方法。每種蛋白質都有自己的等電點，在等電點處溶解度最低。相反，有些蛋白質在壹定的pH值下很容易溶解，所以可以通過調節溶液的pH值來分離純化。蛋白質王紅新等人[8]研究了茶蛋白的提取工藝，發現在pH值時，茶蛋白的提取效果最好，提取率達到36.8%，初始純化率為91.0%。李殿寶[9]從葵花脫脂粕中提取蛋白時，調節蛋白溶液的pH值。目標蛋白質在等電點沈澱。等電點沈澱法也適用於葡萄籽中蛋白質的提取。李等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3.8。他們采用堿溶法提取葡萄籽蛋白，得到了最佳提取工藝:1×10-5mol·L-65438。在40℃下攪拌40 min，葡萄籽中蛋白質的提取率達到73.78%。此外，堿法提取大米蛋白，其持水性、吸油性和起泡性均優於酶法[11]。酸法提取的鰱魚蛋白無腥味，顏色潔白。蛋白質得率高達90%[12]。蛋白質的溶鹽和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白溶解度的現象，其中蛋白質溶解度增加的現象稱為溶鹽，反之亦然。需要指出的是，相同濃度的中性二價離子，如MgCl2和(NH4)2SO4對蛋白質溶解度的影響，要遠大於壹價離子中性鹽，如NaCl和NH4Cl。在葡萄籽蛋白的提取過程中，不僅可以用堿溶法提取蛋白，還可以用鹽溶法提取蛋白。最佳提取工藝為:10%NaCl溶液，按料液比1∶25，30℃攪拌30min，蛋白質提取率為57.25% [10]。鹽析法是從血液中提取免疫球蛋白的常用方法，如多聚磷酸鈉絮凝法和硫酸銨鹽析法，其中硫酸銨鹽析法在生產中應用廣泛。由於硫酸銨在水中呈酸性，為了防止其對蛋白質造成損傷，用氨水將pH值調至中性。為了防止不同分子間的沈澱，蛋白質樣品的含量壹般控制在0.2% ~ 2.0%。通過鹽溶解和鹽析純化蛋白質後，通常通過透析或凝膠過濾去除中性鹽[13]。有機溶劑萃取法的原理是:某些蛋白質在水中的溶解度可被與水混溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)顯著降低；而且在壹定的溫度、pH值和離子強度下，引起蛋白質沈澱的有機溶劑的濃度是不同的。因此，可以通過控制有機溶劑的濃度來分離和純化蛋白質。例如，在冰浴磁力攪拌下，向4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃)，可使冰核蛋白沈澱，從而純化冰核蛋白[14]。因為在室溫下，有機溶劑，而且還伴隨著變性。因此，通常需要冷卻有機溶劑，然後在不斷攪拌下加入有機溶劑，以防止局部濃度過高，這樣就可以在很大程度上解決蛋白質變性的問題。對於某些與脂類結合牢固或分子中有許多極性側鏈、不溶於水的蛋白質，可用乙醇、丙酮、丁醇等具有壹定親水性和較強親油性的有機溶劑提取。是壹種理想的提取溶液。冷乙醇分離法是由Cohn在1949中首先提出的制備丙種球蛋白的方法。冷乙醇分離法也是目前世衛組織法規和中國生物制品法規推薦的方法，不僅分辨率高，純化效果好，而且可以同時分離多種血漿成分。而且具有抑菌、清除、殺滅病毒的作用[15]。萃取是分離純化有機物的常用方法，而雙水相萃取和反膠束萃取可用於分離蛋白質。雙水相萃取(ATPE)是指親水性聚合物溶液在壹定條件下形成雙水相。由於被分離物質在兩相中的不同分布，它可以被分離並廣泛應用於生物化學、細胞生物學和生化工程中產物的分離和提取。該方法可在室溫下進行，雙水相中的聚合物也能提高蛋白質的穩定性，產率較高。對於胞內蛋白，首先需要對細胞進行有效的粉碎。目標蛋白往往分布在上相並濃縮。細胞碎片等固體物質分布在下相。目的蛋白通過雙水相系統濃縮。受聚合物分子量和濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類和濃度的影響[16]反膠束萃取法是通過反膠束包裹蛋白質來萃取蛋白質。反膠束是表面活性劑溶於非極性有機溶劑時自發聚集形成的納米級聚集體。這種方法的優點是蛋清在提取過程中受到反膠束的保護。程世賢等人【17】。用反膠束萃取法提取大豆中的蛋白質。3.根據不同的電荷進行分離純化。根據蛋白質的電荷不同，即酸堿性質不同，有兩種方法分離蛋白質。在外加電場的作用下，帶電粒子(如不在等電點的蛋白質分子)會向電性相反的電極移動。這種現象叫做電泳。聚丙烯酰胺電泳是壹種以聚丙烯酰胺為介質的區帶電泳，常用於蛋白質的分離。其優點是設備簡單，操作方便，樣品用量少。等電聚焦是壹種高分辨率的蛋白質分離技術。它也可以用來測定蛋白質的等電點。通過等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的。在外電場的作用下，各種蛋白質會移動並集中在與其等電點相等的pH梯度上，形成壹個窄帶。孫等[18]研究了聚丙烯酰胺電泳、等電聚焦電泳和等速純化電泳在蛋白質分離純化中的應用。結果表明，聚丙烯酰胺電泳條帶分辨率低。等電聚焦電泳的分辨率最高，可以用最少的加樣量分離同壹蛋白質的亞組分。等速純化電泳區分辨率高，可將樣品分離成單壹組分，樣品量最大。離子交換色譜(Ion exchange chromatography，IEC)是以離子交換劑為固定相，根據可逆交換過程中流動相中組分離子與交換劑上平衡離子之間結合力的不同而進行分離的色譜方法。在離子交換色譜中，基質由帶電荷的樹脂或纖維素組成，帶正電荷的是陰離子交換樹脂。反之就是陽離子交換樹脂。離子交換色譜也可用於蛋白質的分離和純化。蛋白質在不同的pH值時，其帶電情況也不同。與帶負電荷的蛋白質結合的陰離子交換基質留在層析柱上，吸附在層析柱上的蛋白質通過增加洗脫液中鹽的濃度來洗脫。弱結合的蛋白質首先被洗脫。相反，陽離子交換基質與帶正電荷的蛋白質結合，通過逐漸增加洗脫液中的鹽濃度或提高洗脫液的pH值，可以將結合的蛋白質洗脫下來。李等[19]將離子交換色譜法應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的純化。此外，離子交換層析也用於提取抗凝血蛋白[7]。4.利用對配體的特異性親和力進行分離純化親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子的獨特識別能力(即生物親和力)而建立的壹種有效的純化方法。從復雜的混合物中分離目標蛋白通常只需要壹步。並且純度相當高。為了設計最佳的分離條件，在應用親和層析時，有必要了解純化物質的結構和生物學特性。近年來，親和層析被廣泛應用於目的蛋白的分離純化，尤其是疫苗，尤其是融合蛋白的分離純化。由於融合蛋白具有特異性結合能力[20]，親和層析也被廣泛應用於基因工程亞單位疫苗的分離純化[21]。範等[22]用殼聚糖親和層析法提取抑肽酶，其比活為71 428 baee mg-1，純化回收率為62.5%。這種方法成本比較高。