基因工程的概念
基因工程是指根據人的意願進行嚴格設計，通過體外DNA重組和轉基因技術賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人需求的新的生物類型和生物產品。基因工程是在DNA分子水平上設計和構建的，也稱為DNA重組技術。
(壹)基因工程的基本工具
1.“分子手術刀”——限制性核酸內切酶(限制性內切酶)
(1)來源:主要從原核生物中分離純化。
(2)功能:能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，斷裂每條鏈特定部位兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，因此具有特異性。
(3)結果:限制性內切酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式:粘端和平端。
2.“分子縫合針”——DNA連接酶
(1)兩條DNA連接酶(e？大腸DNA連接酶和T4-DNA連接酶)；
①相似性:均為磷酸二酯鍵縫合。
2區別:e？大腸桿菌DNA連接酶來源於T4噬菌體，它只能連接雙鏈DNA片段的互補粘性末端之間的磷酸二酯鍵。T4DNA連接酶可以縫合兩種末端，但連接平端的效率較低。
(2)DNA聚合酶和DNA聚合酶的異同:？DNA聚合酶只能在現有核苷酸片段的末端添加壹個核苷酸，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶連接兩個DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。
3.“分子運輸工具”-載體
(1)載體具備以下條件:①能在受體細胞中復制並穩定保存。
②它有壹個或多個限制酶切點，用於插入外源DNA片段。
③有識別和選擇重組DNA的標記基因。
(2)最常用的載體是什麽？質粒，它是壹種裸露的、簡單的結構，不依賴於細菌染色體，具有自我復制的能力。
(3)其他載體:噬菌體衍生物、動植物病毒。
(2)基因工程的基本操作程序
第壹步:獲得目標基因。
1.目標基因是指編碼蛋白質的結構基因。
2.原核基因是直接分離出來的，真核基因是人工合成的。合成目的基因常用的方法有逆轉錄法和化學合成法。
3.目的基因的PCR擴增
原理(1): DNA雙鏈復制
(2)過程:步驟1:加熱至90-95℃使DNA熔化；第二步:冷卻至55-60℃，將引物結合到互補DNA鏈上；第三步:加熱到70 ~ 75℃，用熱穩定的DNA聚合酶從引物合成互補鏈。
第二步:基因表達載體的構建。
1.目的:使目的基因在受體細胞中穩定存在並能遺傳給下壹代，使目的基因得以表達並發揮作用。
2.組成:目的基因+啟動子+終止子+標記基因。
啟動子(1)是壹段具有特殊結構的DNA片段，位於基因的頭部，RNA聚合酶在此識別結合，並能驅動基因轉錄mRNA，最終獲得所需的蛋白質。
(2)終止子:也是壹種具有特殊結構的DNA片段，位於基因的末端。
(3)標誌基因的作用是鑒別受體細胞是否含有目的基因，從而篩選出含有目的基因的細胞。常用的標誌基因是抗生素基因。
步驟3:將目標基因導入受體細胞
1.轉化的概念:是目的基因進入受體細胞並在受體細胞中保持穩定表達的過程。
2.常見的轉換方法:
將目的基因導入植物細胞:農桿菌轉化是最常用的方法，其次是粒子轟擊和花粉管通道法。
將目的基因導入動物細胞:最常用的方法是顯微註射技術。這種方法的受體細胞多為受精卵。
將目的基因導入微生物細胞:原核生物因其繁殖快、細胞單壹、遺傳物質相對較少而被用作受體細胞。最常用的原核細胞是大腸桿菌。轉化方法是先用Ca2+處理細胞成為感受態細胞，然後將重組表達載體DNA分子溶於緩沖液中，與感受態細胞混合，促使感受態細胞在壹定溫度下吸收DNA分子，完成轉化過程。
3.重組細胞導入受體細胞後，篩選含有基因表達載體的受體細胞的依據是標記基因是否表達。
步驟4:目標基因的檢測和表達。
1.首先，需要利用DNA分子雜交技術檢測目的基因是否插入轉基因生物的染色體DNA中。
2.其次，需要檢測目的基因是否有轉錄的mRNA，方法是用標記的目的基因作為探針與mRNA雜交。
3.最後，從轉基因生物中提取蛋白質，與相應的抗體進行抗原抗體雜交，檢測目的基因是否翻譯成蛋白質。
4.有時需要鑒定個體的生物學水平。比如轉基因抗蟲植物是否具有抗蟲性狀。
(三)基因工程的應用
1.植物基因工程:植物具有抗蟲性、抗病性和抗逆轉性，並通過轉基因技術提高植物的品質。
2.動物基因工程:提高動物生長速度，提高畜產品質量，用轉基因動物生產藥物。
3.基因治療:將正常的外源基因導入患者體內，使基因表達產物發揮作用。
蛋白質工程的概念。
蛋白質工程是指根據蛋白質分子的結構規律及其生物學功能之間的關系，改造現有的蛋白質或制造壹種新的蛋白質，以滿足人類生產生活的需要。(原則上，基因工程只能產生自然界已經存在的蛋白質)
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主題2細胞工程
(壹)植物細胞工程
1.理論基礎(原理):細胞全能性
全能性表達的難度:受精卵>生殖細胞>幹細胞>體細胞；植物細胞>動物細胞
2.植物組織培養技術
(1)過程:離體植物器官、組織或細胞→愈傷組織→試管苗→植株。
(2)用途:微繁殖、作物脫毒、人工種子生產、單倍體育種和細胞產品的工業化生產。
(3)地位:培育植物新品種是培育轉基因植物和植物體細胞雜交的最後壹道工序。
3.植物體細胞雜交技術
(1)流程:
(2)誘導融合的方法:物理方法包括離心、振動和電刺激。化學方法壹般使用聚乙二醇(PEG)作為誘導劑。
(3)意義:克服遠緣雜交不親和的障礙。
(2)動物細胞工程
1.動物細胞培養
(1)概念:動物細胞培養是從動物體內取出相關組織，分散成單細胞，然後放入合適的培養基中，讓這些細胞生長繁殖。
(2)動物細胞培養的過程:取動物組織塊(動物胚胎或幼齡動物的器官或組織)→切片→用胰蛋白酶或膠原酶處理並分散成單細胞→制成細胞懸液→轉入培養瓶中進行原代培養→用胰蛋白酶或膠原酶處理覆蓋在瓶壁上的細胞並分散成單細胞，繼續傳代培養。
(3)細胞粘附和接觸抑制:懸液中分散的細胞迅速粘附在瓶壁上，稱為細胞粘附。細胞的數量在增加。當貼壁細胞分裂生長到表面並相互抑制時，細胞就會停止分裂增殖。這種現象被稱為細胞接觸抑制。
(4)動物細胞培養需要滿足以下條件
①無菌無毒環境:培養液應滅菌。通常在培養液中要加入壹定量的抗生素，防止培養過程中的汙染。另外，要定期更換培養基，防止代謝產物的積累對細胞本身造成傷害。
②營養:合成培養基成分:糖、氨基酸、生長促進因子、無機鹽、微量元素等。通常需要添加血清、血漿等天然成分。
③溫度:適宜溫度:哺乳動物36.5℃±0.5℃；pH值:7.2~7.4 .
④氣體環境:95%空氣+5% CO2。O2是細胞代謝所必需的，CO2的主要作用是維持培養基的pH值。
(5)動物細胞培養技術的應用:病毒疫苗的制備、單克隆抗體的制備、有毒物質的檢測、醫學研究用各種細胞的培養。
2.動物體細胞核移植技術與克隆動物
(1)哺乳動物核移植可分為胚胎核移植(容易)和體細胞核移植(困難)。
(2)選擇去核卵母細胞(母細胞)的原因是卵母細胞(母細胞)比較大，容易操作；卵(母)細胞富含細胞質和營養。
(3)體細胞核移植的壹般過程是:(右)
核移植
胚胎移植
(4)體細胞核移植技術的應用:
①加快家畜遺傳改良進程，促進優良畜群的選育；(2)保護瀕危物種，增加幸存者數量；
③生產珍貴的醫用蛋白質；④作為異種移植供體；
⑤用於組織器官移植。
(5)體細胞核移植技術中的問題:
克隆動物有健康問題，表現出遺傳和生理缺陷。
3.動物細胞融合
(1)動物細胞融合又稱細胞雜交，是指兩個或兩個以上的動物細胞結合形成壹個細胞的過程。融合後形成的具有兩個或兩個以上細胞原有遺傳信息的單核細胞稱為雜交細胞。
(2)動物細胞融合的原理與植物原生質體融合基本相同，誘導動物細胞融合的方法與植物原生質體融合相似。常用的誘發因素有聚乙二醇、滅活病毒和電刺激。
(3)動物細胞融合的意義:克服了遠緣雜交的不親和性，成為研究細胞遺傳學、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段。
(4)動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較:
比較細胞融合的原理、細胞融合的方法、誘導方法和細胞融合的用途
植物體細胞雜交的細胞膜流動性誘導原生質體融合，去細胞壁後離心、電刺激、振動，用聚乙二醇等試劑克服遠緣雜交的不親和性，獲得雜交植株。
動物細胞融合細胞膜的流動性使細胞分散並誘導細胞融合。除了植物細胞雜交外，還加入滅活病毒誘導制備單克隆抗體。
4.單克隆抗體
抗體(1):壹個B淋巴細胞只分泌壹種特異性抗體。從血清中分離的抗體產量低、純度低、特異性差。
(2)單克隆抗體的制備過程
(3)雜交瘤細胞的特點:既能大量繁殖，又能產生特異性抗體。
(4)單克隆抗體的優勢:特異性強，靈敏度高，可大量制備。
(5)單克隆抗體的作用:
①作為診斷試劑，通過準確識別各種抗原物質的細微差異，並與某些抗原特異性結合，具有準確、高效、簡便、快速的優點。
②用於治療疾病和攜帶藥物:主要用於治療癌癥，可制成“生物導彈”，少量也用於治療其他疾病。
主題3胚胎工程
(壹)動物胚胎發育的基本過程
1.胚胎工程是指對動物早期胚胎或配子的各種顯微操作和加工技術，如胚胎移植、體外受精、胚胎分割、胚胎幹細胞培養等技術。處理後獲得的胚胎需要移植到雌性動物體內產生後代，以滿足人類的各種需求。
2.動物胚胎發育的基本過程。
(1)受精部位是母親的輸卵管上段。
(2)卵裂期:特征:細胞有絲分裂，細胞數量在增加，但胚胎整體體積不增加，或略有減少。
(3)桑葚:特點:胚胎細胞數達到32個左右時，胚胎形成致密的細胞團，看起來像桑葚。這是壹種全能細胞。
(4)囊胚:特征:細胞開始分化(這個時期細胞全能性還是比較高的)。聚集在胚胎壹端的較大細胞稱為內細胞團，將來會發育成胎兒的各種組織。中間的空腔叫囊胚腔。
(5)原腸胚:特征:具有三胚層的分化，有胚泡腔和原腸胚腔。
(2)胚胎幹細胞
1.哺乳動物胚胎幹細胞(簡稱ES或EK細胞)來源於早期胚胎或分離自原始性腺。
2.具有胚胎細胞的特征，體積小，細胞核大，核仁明顯；在功能上，它具有發育全能性，可以分化成成年動物的任何壹種組織細胞。另外，在體外培養的條件下，可以不分化增殖，可以冷凍保存，也可以進行基因改造。
3.胚胎幹細胞的主要用途是:
①可用於研究哺乳動物個體發育和發育的規律；
②是體外研究細胞分化的理想材料。在培養基中添加牛磺酸等化學物質，可以誘導es細胞分化為不同類型的組織細胞，為揭示細胞分化和雕亡的機制提供了有效手段。
③可用於治療人類的壹些慢性疾病，如帕金森綜合癥、青少年糖尿病等。
④利用被誘導分化為新組織細胞的特性，移植的ES細胞可以修復壞死或變性的部位，恢復正常功能；
⑤隨著組織工程技術的發展，通過體外誘導es細胞分化，定向培養人工組織和器官，用於器官移植，解決器官移植後供體器官不足和免疫排斥等問題。
(三)胚胎工程的應用
1.體外受精和早期胚胎培養
(1)卵母細胞的收集和培養；
主要方法:使用促性腺激素，使其排出更多的卵子。然後，從輸卵管中洗出卵子，在體外直接與獲能精子受精。第二種方法:從新宰殺的母畜卵巢中收集卵母細胞；第三種方法是通過超聲波探測器和腹腔鏡直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細胞。收集的卵母細胞必須在體外進行人工培養和成熟，然後才能與獲能精子受精。
(2)精子采集和獲能:體外受精前，精子應獲能。
(3)受精:獲能精子和培養的成熟卵細胞在獲能液或特殊受精液中完成受精過程。
(4)早期胚胎培養:精子和卵子體外受精後，將受精卵轉移到發育培養液中繼續培養，以檢查受精狀態和受精卵的發育能力。培養基成分復雜，除了壹些無機鹽和有機鹽外，還需要添加維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營養物質，以及血清等物質。當胚胎發育到合適的階段，可以取出，移植給受體或冷凍保存。不同的動物有不同的胚胎移植時間。牛羊只有培養到桑椹胚或囊胚期才能移植。小鼠、兔等實驗動物可早期移植，人類體外受精胚胎可在8~16細胞期移植。)
2.胚胎移植
(1)胚胎移植是指將雌性動物的早期胚胎，或通過體外受精等方式獲得的胚胎，移植到其他具有相同生理狀態的同種雌性動物體內，使其繼續發育為新個體的技術。其中，提供胚胎的個體稱為“供體”，接受胚胎的個體稱為“受體”。(供體為優良品種，作為受體的母畜應為普通或大原種品種。)
現狀:任何胚胎工程技術產生的胚胎，如轉基因、核移植、或體外受精，都必須經過胚胎移植技術才能獲得後代，這是胚胎工程的最後壹道“工序”。
(2)胚胎移植的意義:大大縮短了供體本身的生殖周期，充分發揮了優秀雌性個體的生殖能力。
(3)生理基礎:①動物發情排卵後，同壹動物的供體和受體生殖器官的生理變化是相同的。這為供體胚胎移入受體提供了相同的生理環境。
②早期胚胎在壹定時間內處於自由狀態。這使得收集胚胎成為可能。
③受體對移植入子宮的外來胚胎沒有免疫排斥反應。這為受體體內胚胎的存活提供了可能性。
④供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理和組織學聯系，但供體胚胎的遺傳特性在妊娠期間不受影響。
(4)基本程序主要包括:
①供體和受體的選擇和處理。選擇遺傳特征和生產性能優良的供體，體格健康、生殖能力正常的受體。捐獻者和接受者是同壹物種。供體母牛的激素同期發情和促性腺激素超數排卵。
②配種或人工授精。
③胚胎的收集、檢查、培養或保存。配種或授精後第7天，供體牛子宮內的胚胎用專門的洗卵器洗出(也叫洗卵)。檢查胚胎的質量，此時胚胎應該發育到桑葚或胚泡階段。直接移植到受體體內或保存在-196℃的液氮中。
④胚胎移植。
⑤移植後檢查。檢查受體牛是否懷孕。
3.胚胎分割
(1)概念:是指通過機械手段將早期胚胎切割成2等份和4等份，通過移植獲得同卵雙胞胎或多胞胎的技術。
(2)意義:來自同壹個胚胎的後代具有相同的遺傳物質，屬於無性繁殖。
(3)材料:發育良好、形態正常的桑椹胚或囊胚。在桑椹胚到囊胚的發育過程中，細胞開始分化，但全能性仍然較高，也可用於胚胎分割。)
(4)操作過程:囊胚期胚胎分裂時，內細胞團要等分，否則會影響分裂胚胎的恢復和進壹步發育。
議題4生物技術的安全和倫理問題
(壹)轉基因生物的安全性爭論:
(1)基因生物學與食品安全；
反對觀點:反對“實質等效”、滯後效應、新過敏原和營養成分變化。
正面觀點:安全性評價，科學家負責任的態度，無例無據。
(2)轉基因生物和生物安全:對生物多樣性的影響
相反的觀點:擴散出種植區成為野生物種，成為外來入侵物種，重組有害病原體，成為超級雜草，可能造成“基因汙染”
正面觀點:生命力有限，生殖隔離，花粉傳播距離有限，花粉存活時間有限。
(3)轉基因生物與環境安全:對生態系統穩定性的影響。
反對觀點:打破物種界限、二次汙染、有害病原微生物和有毒蛋白質的重組都可能通過食物鏈進入人體。
正面觀點:不改變生物原有分類狀態，減少農藥使用，保護農田土壤環境。
(B)生物技術的倫理問題
(1)克隆人:有兩種不同的觀點，大多數人持否定態度。
否定理由:克隆人嚴重違反人類倫理，是對克隆技術的濫用；克隆人沖擊了婚姻、家庭、兩性關系等現有的傳統倫理觀念；克隆人是因為人工創造而心理和社會地位不健全的人。
正面原因:技術問題可以通過胚胎分級、基因診斷、染色體檢查來解決。不成熟的技術只有通過實踐才能成熟。
中國政府的態度:禁止生殖性克隆，不反對治療性克隆。四不原則:不贊成、不允許、支持、不接受任何生殖性克隆人的實驗。
(2)試管嬰兒:試管嬰兒的兩個目的有兩個區別。大多數人同意不同的觀點。
負面原因:把試管嬰兒當成人體零件廠，是對生命的不尊重；早期生命也有生存的權利。拋棄或殺死多余的胚胎無異於“謀殺”。
正面理由:解決了不孕不育的問題，為骨髓造血幹細胞治療患者提供了最好最快的方法，不會對試管嬰兒造成損傷。
(3)基因身份證:
否認理由:個人基因信息泄露導致基因歧視，必然導致基因失業、個人婚姻困難、人際疏遠等嚴重後果。
正面原因:通過基因檢測，可以盡早采取預防措施，及時進行治療，達到挽救患者生命的目的。
⑶生物武器
(1)種類:病原菌、病毒、生化劑、基因重組後的病原菌。
(2)傳播方式:吸入、誤食、接觸染病物品、被染病昆蟲叮咬等。
(3)特點:致病性強，多數情況下具有傳染性，感染途徑多，汙染面廣，潛伏期長，不易發現，危害時間長等。
⑷《生物武器公約》與中國政府的態度。