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多重PCR技術知多少

敏感性可以從兩方面分析:Analytical Sensitivity (檢測敏感性)和Clinical Sensitivity (臨床敏感性)。

Analytical Sensitivity (AS)強調的是檢測結果:如果標本中含有被檢測物,檢測成功的幾率是多少。如果是PCR反應,就是能檢測到的最低拷貝數。壹個能檢測到壹個拷貝病原體的test,顯然要比壹個需要壹萬個拷貝才能給出陽性結果的檢測敏感性高。

Clinical Sensitivity(CS)是從臨床角度看問題:實驗結果給病人出診斷的成功率有多高。

如果壹個病僅有壹個病因,檢測敏感性和臨床敏感性無差別。如果疾病的診斷需要同時分析多病因,僅對壹個指標進行檢測,檢測敏感性再高其臨床敏感性也要大打折扣。qPCR 的檢測敏感性是無可爭議的,可是因為無法做多重,所以臨床敏感性不夠好。多重PCR臨床敏感性要高很多。

多重PCR有著重要的臨床意義和廣泛的應用前景,但是仍然存在很多限制性因素,其中多重PCR擴增效率的壹致性壹直是最大的難題,擴增子越多、不均壹性越高等。針對多重PCR存在的問題,市面上多家生物研發公司均有著自己的應對策略,各有優勢。據筆者了解,目前上海翼和生物利用自主研發的多重PCR引物設計軟件結合知識密集型的多重PCR優化技術服務,並且采用獨有的引物基團修飾技術,使得數百個擴增子片段,均能被有效擴增在引物上完成化學基團的修飾後,引物之間無法隨機匹配,引物所帶的修飾基團能隔離開其他引物,因此更多的引物都可以在單管PCR體系中完成,並且修飾基團在熱變性後會消失。並且在建庫過程中引物端自動加上樣本區分barcode,無需二次建庫。

翼和生物技術顧問肖君華博士介紹,該公司的多重PCR技術,均壹性高,90%擴增子達到15個reads以上;特異性高,90%的靶序列均能被有效擴增,結合該技術的建庫試劑盒適用於當前各類高通量測序儀器的富集文庫構建,包括PGM,Miseq,Hiseq各類機型和試劑盒。"我們的多重PCR技術已使用於基於高通量平臺的各類技術服務,如目標序列重測序,高通量SNP檢測服務,高通量微衛星(STR/SSR)檢測服務。"

引物設計圖

在後基因組時代,對基因組候選區段的重測序需求日益增加,人們對序列的關註超過了少數的SNP,候選區段的範圍可能在5Kb-100Kb之間,使用傳統sanger法或目標區域雜交捕獲測序價格昂貴,使用多重PCR目標區域捕獲測序很好的解決了這壹難題。通過多重PCR對擴增整個基因區域,壹次性捕獲,結合高通量測序技術,多樣本同時測序,在大樣本量篩查的同時極大的降低成本。本方法適用於孟德爾遺傳性疾病的篩查和診斷、GWAS候選區段重測序、QTL定位區段重測序、精準醫療研究與應用。

高通量SNP檢測服務結合多重PCR和高通量測序技術,對需要檢測的位點設計特異性引物,在單管內進行多重PCR擴增,不同的樣本以不同的barcode引物區分。混合樣本後,在測序平臺上,對擴增子進行測序,測序結果使用生物信息學方法,區分不同樣本,最終獲得每個位點的SNP信息。本方法適用於不同目的遺傳學研究,例如疾病基因組研究,腫瘤基因組研究,疾病與基因的關聯研究,臨床分子診斷等,在植物基因組研究中,可用於QTL定位及分子育種,非常適合大規模樣本的SNP分析。

針對價格問題,肖博士表示,目前市面上,靶向序列多重PCR產品多采用LM-PCR技術,及連接介導(ligation-mediated PCR)多重PCR建庫試劑盒,通過市場調查,LM-PCR建庫時,建庫成本在300-400元/樣品,而翼和生物的多重PCR建庫成本在100元/樣本。

多重PCR不僅僅是為了增加效率或者降低費用,更重要的是沒有多重,分子診斷的臨床意義就不大,應用就不夠廣泛。

臨床應用中,翼和生物還發揮了更多的作用,開發包括化療藥物療效和毒副作用相關位點檢測、乙肝病毒分型及YMDD突變檢測、華法林相關SNP檢測和氯匹格雷相關SNP檢測的產品等。此外還研發改良了多種分子遺傳學技術服務手段,最具代表性的服務平臺包括低中高通量單核苷酸多態性(SNP)檢測,中高通量微衛星(STR/SSR)檢測,二代多重PCR擴增子建庫,二代靶向重測序,拷貝數變異多樣性(CNV)檢測,實驗小鼠遺傳背景鑒定,細胞鑒定多種基因表達定量(MCF)檢測,microRNA檢測等平臺。

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