DNA改組技術
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隨著PCR技術的發展和應用，1994年，美國stemmer提出了壹種全新的人工分子進化技術——DNA改組(又稱改組技術)，可以模擬生物幾百年的分子進化過程，可以在很短的實驗周期內定向篩選出特定基因編碼的酶蛋白活性提高幾百倍甚至幾萬倍的功能突變基因。基本原理是用DNA核酸酶I消化壹組來源不同但功能相同的同源基因，產生隨機的小片段，這些小片段形成壹個文庫，可以作為PCR擴增的引物和模板。當壹個基因拷貝片段被用作另壹個基因拷貝的引物時，發生模板轉換和重組。導入體內後，選擇陽性突變體進行新壹輪體外重組。壹般通過2-3個循環，可以獲得產物大大提高的重組突變體。
2自然繁殖
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將自然界中的微生物不經人工誘變或雜交分離純化(見微生物的分離純化)，然後進行純培養和測定(見微生物測定方法)，首先選擇微生物的菌株。這種方法簡單可行，但獲得優良菌株的概率較小，壹般難以滿足生產的需要。
3人工繁殖
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有誘變育種和雜交育種兩種。
誘變育種
基因誘變微生物育種技術。1927年，H.J .馬勒發現X射線可以增加突變率。1944年，C. auerbach首先發現了氮芥氣體的誘變作用；隨後，許多物理(如紫外線、γ射線、快中子等。)和化學誘變因子相繼被發現。化學誘變因素有三種:①突變體與壹個或多個核酸堿基發生化學變化，引起DNA復制過程中的堿基置換，如亞硝酸羥胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基胍、亞硝基甲基脲等。②突變體是天然堿基的結構類似物，在復制過程中加入DNA分子時會引起變異，如5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤、2-氨基嘌呤等。③突變體在DNA分子上減少或增加1 ~ 2個堿基，導致堿基突變點以下所有遺傳密碼的轉錄和翻譯出現錯誤，從而導致密碼群移動突變體的出現，如吖啶類物質和壹些氮芥衍生物(ICR)。誘變育種具有操作簡單、突變率高、突變譜廣等優點。它不僅可以提高產量，改善質量，而且可以擴大產品品種，簡化工藝條件。比如1943從自然界分離出的產青黴素細菌，效價只有20單位/ml，經過壹系列的誘變育種，效價已經達到40000單位/ml；誘變後，去甲基金黴素在發酵液中積累。谷氨酸棒桿菌1299經紫外誘變後可生產賴氨酸和纈氨酸，增加了產品的品種。經過誘變，篩選出能減少泡沫的突變菌株，從而提高發酵罐的利用率。誘變育種的不足是缺乏方向性。
雜交育種
不同基因型的菌株或屬通過交配或體細胞融合形成雜種，或通過轉化和轉導形成重組體，然後從這些雜種或重組體或其後代中選擇優良菌株。通過該方法，可以分離出具有新基因組合的重組體，還可以選擇出生長旺盛、生物量大、適應性強、酶活性提高的新菌株。雜交育種的方法因實驗菌株的繁殖方式而異，如有性雜交、準重組、原生質體融合、轉化、轉導、雜交質粒轉化等。但選擇親本，培育分離群體後代，優中選優，淘汰最差，雜種遺傳分析的過程基本相同。雜交壹般是指有交配反應的品系交配或接合，形成雜種。該方法應用範圍廣泛，在葡萄酒、面包、藥用和飼料酵母的育種，鏈黴菌和青黴抗生素產量的提高，曲黴酶活性的增強等方面都取得了成功。
體細胞融合是沒有性反應的品系或物種之間的細胞融合和染色體重組。首先用酶溶解細胞壁，然後用氯化鈣-聚乙二醇處理原生質體，促進融合，獲得雜種。該方法對工業微生物菌種的改良起到了積極的作用。
轉化和轉導最早應用於細菌，現在已廣泛應用於鏈黴菌和酵母菌。隨著重組DNA技術的發展，重組質粒的構建和轉化體系的建立，可以將目的基因轉入受體細胞，並產生能產生生物活性物質(如疫苗、酶等)的菌株。)具有重要的經濟價值。
微生物與釀酒工業、食品工業、生物制品工業等密切相關。它們的菌種質量直接關系到許多工業產品的質量，甚至影響到人們的日常生活質量，因此需要培育優質高產的微生物菌種。微生物育種的目的是引導生物合成的代謝途徑向所需方向發展，或促進細胞內基因的重組以優化遺傳性狀，人為積累壹些代謝產物，以獲得高產、優質、低耗的所需菌株。誘變育種作為其中壹種方法，已被廣泛應用。目前，國內微生物育種界仍主要采用常規理化因子等誘變方法。此外，原生質體誘變技術已廣泛應用於酶制劑、抗生素、氨基酸、維生素等菌種的選育，並取得了許多重大成果。
4誘變育種
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1.1物理突變
1.1.1紫外線照射
紫外線照射是壹種常用的物理誘變方法，也是誘導微生物突變的壹種非常有用的工具。DNA和RNA中嘌呤和嘧啶的最大吸收峰在260nm，因此260nm的紫外線是最有效的致死劑。紫外線的作用有很多解釋，但確定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚體[1]。二聚體的形成會阻礙堿基之間的正常配對，因此可能導致突變甚至死亡[2]。
紫外輻照誘變簡單經濟，在壹般實驗室條件下即可實現，正突變概率高。這種方法主要用於酵母菌株的誘變。
1.1.2電離輻射
γ射線是電離生物學中應用最廣泛的電離射線之壹。它能量高，能產生電離，電離能直接或間接改變DNA的結構。直接影響就是脫氧核糖的堿基可以被氧化，或者脫氧核糖的化學鍵和糖與磷酸的化學鍵。其間接作用是水或有機分子能產生自由基，自由基能與細胞內溶質分子發生化學變化，導致DNA缺失和損傷[2]。
除了γ射線，電離輻射還包括X射線、β射線和快中子。電離輻射有壹定的局限性，操作要求高，有壹定的危險性，通常用於其他誘變劑不能使用的誘變育種過程。
1.1.3離子註入
離子註入是80年代初出現的高新技術。主要用於金屬材料的表面改性。從1986開始逐漸用於作物育種，近年來逐漸引入微生物育種[3]。
在離子註入過程中，生物分子吸收能量並引起復雜的物理和化學變化。這些變化的中間產物是各種活性自由基。這些自由基會對其他正常生物分子造成損害，破壞細胞中的染色體突變和DNA鏈，還會破壞質粒DNA。由於離子註入範圍可控，隨著微束技術和精確定位技術的發展，定位誘變將成為可能[4]。
用於微生物誘變育種的離子註入在壹般實驗室條件下難以實現，目前應用相對較少。
1.1.4激光
激光是壹種光量子流，也稱為光學粒子。激光輻射可以通過光、熱、壓力和電磁場效應的綜合應用，直接或間接地影響生物體，引起染色體畸變效應、酶的激活或失活、細胞分裂和細胞代謝活動的變化。光量子壹旦作用於細胞內含物中的任何物質，都可能導致生物有機體的細胞學和遺傳學特征的變異。不同種類的激光照射生物有機體表現出不同的細胞學和遺傳學變化[5]。
激光作為壹種育種方法，具有操作簡單、使用安全等優點，近年來在微生物育種方面取得了很多進展。
1.1.5微波
微波輻射是壹種低能電磁輻射，在300MHz~300GHz的頻率範圍內具有很強的生物效應，對生物體有熱效應和非熱效應。它的熱效應意味著它可以導致生物的局部溫度升高。從而引起生理和生化反應；非熱效應是指微波作用下與溫度無關的各種生理生化反應。在這兩種效應的共同作用下，生物會產生壹系列的突變效應[6]。
因此，微波也被用於農作物育種、動物育種和工業微生物育種等多個領域的誘變育種，並取得了壹定的成果。
1.1.6太空育種
太空育種又稱太空誘變育種，是利用高空氣球、返回式衛星、飛船等航天器將農作物種子、組織、器官或生命個體搭載到太空，利用太空的特殊環境使生物基因發生變異，然後返回地面進行育種、培育新品種、新材料的壹種農作物育種新技術。空間環境因素主要包括微重力、空間輻射以及交變磁場、超真空環境等其他誘變因素。這些因素的相互作用導致生物系統中遺傳物質的損傷，從而導致突變、染色體畸變、細胞失活、發育異常等生物學現象的發生。
與其他育種方法相比，航天育種是航天技術與微生物育種技術的有機結合，技術含量高、成本高，是單個科研人員或壹般科研單位難以實現的。只能結合航天技術，由國家完成。
1.1.7大氣壓室溫等離子體誘變育種
大氣壓室溫等離子體(簡稱ARTP)是指具有高濃度活性粒子(包括受激氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)的等離子體射流。)在大氣壓下。ARTP技術作為壹種新的物理方法，在微生物誘變育種領域具有廣闊的應用前景。
血漿中適當劑量的活性粒子可以改變微生物細胞壁/膜的結構和通透性，引起基因損傷。菌株被遺傳物質損傷後，微生物啟動SOS修復機制，誘導不具備3ˊ核酸外切酶校正功能的DNA聚合酶ⅳ和V。因此，即使DNA鏈受損部分存在不成對的堿基，復制也能繼續。在這種情況下允許錯配可以增加存活的幾率。ARTP對遺傳物質造成的損害具有高度多樣性；而且SOS誘導的修復本身是容錯的，所以修復過程中ARTP多樣性的破壞很可能會被包含在DNA鏈中，並且在微生物復制修復時可能會帶來多樣性錯配的可能。
ARTP應用於微生物誘變育種，成本低，操作方便，物理誘變設備(如離子束註入)所需的離子或電子加速、真空、制冷等輔助設備不多。ARTP對遺傳物質的損傷機制多樣，正突變率高，突變表現多樣，對真菌、細菌、藻類等都有影響。ARTP對環境無汙染，確保操作人員的人身安全。無論用哪種氣體放電，都不會產生有害氣體。[1]
5化學誘變
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2.1.1烷化劑
烷化劑可以與壹個或幾個核酸堿基反應，導致DNA復制和遺傳變異過程中堿基配對的轉變。常用的烷化劑有甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、乙烯亞胺、硫酸二乙酯等。
甲基磺酸乙酯(EMS)是最常用的烷化劑，其致突變率很高。其誘發的突變多為點突變，具有很強的致癌性和揮發性，5%的硫代硫酸鈉可作為終止劑和解毒劑。
N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)是壹種超誘變劑，應用廣泛，但有壹定毒性，操作時應註意。在堿性條件下，NTG會形成重氮甲烷(CH2N2)，這是導致死亡和突變的主要原因。其作用可能是由DNA與CH2N2的烷基化作用引起的[2]。
硫酸二乙酯(DMS)也是常用的，但由於毒性很強，目前很少使用。乙烯亞胺，產量少，很難買到。使用濃度為0.0001%~0.1%，具有高度致癌性，需配緩沖液。
2.1.2堿基類似物
堿基類似物的分子結構與天然堿基相似，可以整合到DNA分子中，導致DNA復制過程中的錯配、mRNA轉錄紊亂、功能蛋白重組和表型改變。這些物質毒性相對較小，但負突變率較高，往往很難得到好的突變體。主要有5-氟尿嘧啶(5- FU)、5-溴尿嘧啶(5- BU)和6-氯嘌呤。程等[25]用5- BU對產色素細菌(分枝桿菌T17- 2- 39)的細胞進行誘變，平均生物量增加了22.5%。
2.1.3無機化合物
致突變作用壹般，危險性小。常用氯化鋰，白色結晶，使用時配制成0.1%~0.5%溶液，也可直接加入誘變固體培養基中30 min ~ 2天。亞硝酸鹽容易分解，所以現在用。常用亞硝酸鈉和鹽酸制備亞硝酸鈉，亞硝酸鈉的濃度為0.01~0.1mol/L，使用時可加入相同濃度和體積的鹽酸。
2.1.4其他
還原劑鹽酸羥胺作用於C使G- C變為A-T，也是常用的，濃度為0.1% ~ 0.5%，作用時間為60 min ~ 2 h。
另外，誘變時，兩種或兩種以上誘變因子聯合使用，或同壹誘變因子反復使用，效果更佳。顧等[7]以谷氨酸棒桿菌- 13761為出發菌株，經DMS和反復誘變，獲得壹株產L-組氨酸菌株。
2、誘變劑
2.1突變體選擇
在選擇誘變劑時，需要註意誘變劑的特異性，即壹種誘變劑或突變處理優先使基因組的某些部分發生突變，而其他部分很少發生突變，如果有的話。雖然誘變劑特異性的分子基礎還不太清楚，雖然相關的修復途徑肯定對其有影響，但它們之間的關系並不是那麽簡單，其他因素，包括誘變處理的環境條件，也會影響突變類型。
工業遺傳學家很難正確預測改良某個菌株需要什麽樣的分子突變。因此，為了產生盡可能多類型的突變體，最合適的方法是采用幾種互補類型的突變處理。遠紫外線無疑是最合適的誘變劑，它似乎能誘發所有已知類型的損傷。也很容易采取有效安全的預防措施。在化學誘變劑中，液體試劑比粉末試劑更容易安全操作。另壹個缺點是，它傾向於產生緊密相連的突變簇，盡管這種效應在壹些系統中可能是有利的條件。最後，必須認識到某些特定的菌株可能不會被某些誘變劑誘變。當然，這可以很容易地通過測量容易檢測的突變體，如抗藥性突變體或原營養回復體的突變動力學來驗證。[8]
2.2誘變劑的劑量
從隨機篩選的最佳效果來看，誘變劑的最佳劑量是在用於篩選的存活群體中獲得所需突變體的比例最高，因為這樣會使其在效價測定階段更加省力。
因此，在菌株改良前，為了確定誘變劑的最佳劑量，為誘變增強技術奠定基礎，通常明智的做法是在處理不同菌株時，確定不同誘變劑的誘變動力學。高單位突變本身有時無法確定最佳劑量，因為很難檢測到這種突變。但如果使用耐藥標誌物等易於檢測的標誌物，只要估計方法的局限性，還是可以提供壹些有價值的信息。