《最後的晚餐》寬420厘米，長910厘米。達芬奇不僅在繪畫技巧上力求創新，在畫面的布局上也有新意。壹直以來，畫面的布局都是耶穌門徒坐成壹排，耶穌壹個人坐在壹頭。達芬奇讓十二門徒坐在耶穌兩側，耶穌獨自坐在中間，他的臉被身後明亮的窗戶反射著，神情肅穆。
背景的強烈對比使人們把所有的註意力都集中在耶穌身上。耶穌旁邊不安分的門徒，面部表情、眼神、動作都不壹樣。尤其是驚慌失措的猶大，用手肘碰倒了鹽罐，身體向後壹靠，充滿了驚慌和焦慮。
達芬奇的《最後的晚餐》最初的創作構思是從卡斯塔諾的作品開始的。在達芬奇的素描中，猶大獨自坐在長桌的另壹邊。耶穌正把面包遞給猶大，所有人的註意力都轉向了猶大。為了給猶大形成壓倒性的氣勢，達芬奇在素描中提出了明顯的地平線。
達芬奇在素描中也借鑒了卡斯塔諾的做法，讓弟子約翰躺在桌子上。在過去，傳統的繪畫方法是按照聖經原文中的描述，讓約翰投入耶穌的懷抱。小品裏的每個人幾乎都抄襲了生活中的素材，人物情態激烈，動作大，但彼此聯系很少。
列奧納多·達·芬奇繼承了卡爾·馬克思對宗教主題的情節手法——在畫中講述了壹個生動真實的故事。這種宗教題材的世俗化傾向在15世紀進壹步發展。當時，許多畫家喜歡在此時此地的真實環境中展示聖經故事，並常常以畫出他們自己和他們的朋友在其中的形象為榮。？
列奧納多·達·芬奇采用了平行透視的方法，使用最傳統的線性構圖慣例，這樣中心焦點就在耶穌明亮的前額上。耶穌伸出雙手，垂下眼睛。他說完話，沈默了。但他的舉手投足卻有著不可抗拒的精神感召力，召喚和啟迪人們去自省和沈思。
作品運用了高超的光影技巧。“達芬奇被認為是明暗對比之父，尤其是他的《最後的晚餐》，在後來的藝術中第壹次將明暗作為構圖因素使用”，所有的人物都以神秘安靜的光影為主。與卡斯塔諾和其他三位畫家不同，達芬奇使用陰影消除了所有應該在背景中的細節。
沃爾夫林說，為了精神上的統壹，在達芬奇的作品中，“只有能給觀者帶來愉悅或分散註意力的因素才被從場景中去除。”只有能滿足這個主題迫切需求的東西？提供給想象力。沒有什麽是為自身而存在的:畫中的壹切都是為了整體。"
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