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酶活力的測定方法及原理

酶活力的測定方法:有兩種主要方法即終止反應法和連續反應法。

終止反應法:是在恒溫反應系統中,每隔壹定時間,取出壹定體積的反應液,用強酸強堿或SDS以及加熱等使反應立即停止,然後用化學法放射性化學法或酶偶聯法分析產物的形成量或底物的消耗量。這是最經典的酶活力測定方法,幾乎所有的酶都可以根據這壹原理設計出具體的測定方法。

連續反應法:無須終止反應,而是在酶反應過程中用光化學儀器或電化學儀器等來監測反應的進行情況,對記錄結果進行分析,然後計算出酶活力。

酶活性測定的原理:

1. 超氧物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)

活性的測定 SOD采用氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium,NBT)法(Beauchamp和Fridovich,1971)。反應步驟為:取200μl粗提液,加入3.7 ml NBT反應液50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖液(PBS)配制的含77.12μmol/L氮藍四唑, 100μmol/LEDTA-Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕,在30℃下保溫2分鐘後加入100μl核黃素溶液(pH7.8的50mmol/L磷酸緩沖液中含80.2μmol/L 核黃素和100μmol/LEDTA-Na2),在4000Lx日光下反應20min。然後迅速測定A560。以不照光的管做空白。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。酶活性按以下公式計算:以抑制NBT光化還原的50%為壹個SOD活性單位,結果以U/mg蛋白表示。以加緩沖液代替酶液的作為對照。

SOD總活性=(Ack-AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中, Ack為照光對照管的吸光度;AE為樣品管的吸光度;V為樣品液總體積(ml);Vt為測定時樣品用量(ml);W為樣品鮮重(g)或蛋白質含量(mg)。

2. 過氧化氫酶(Catalase,CAT)

活性測定 CAT 活性參照Aebi (1984)[7]的方法進行測定。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL 。400 μL反應液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0),30 mmol/L的H2O2和50 ?L粗酶液。反應從加入過氧化氫開始計時,連續測定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定義為:壹個過氧化氫酶單位相當於在規定條件下於溫度25℃,pH7.0條件下1分鐘分解1μmol過氧化氫所需酶量,結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。

3. 多酚氧化酶(Polyphenoloxidase,PPO)

活性的測定 PPO活性測定采用鄰苯二酚法(Aquino-Bola?os和Mercado-Silva,2004)。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。350?L反應液(用50mmol/L,pH6.4的PBS配制,內含100?mol/L鄰苯二酚)中加入50 ?L的粗酶液,平衡1分鐘後連續測定398nm吸光度的變化。以1分鐘內398nm吸光度上升0.01為壹個酶活性單位,結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。

4. 過氧化物酶(Peroxidase,POD)

活性測定POD活性測定采用愈創木酚法(Lurie等,1997)。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。反應體系為30μL粗酶液,290 ?L 0.3%愈創木酚(用50 mmol/L的PBS配制,pH 6.4)和 80?L0.3%H2O2(用50 mmol/L的PBS配制,pH 6.4)。反應在加入H2O2 後開始準確記時。連續吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分鐘上升0.01為壹個單位,結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。

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