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如何將多克隆抗體進行分離純化?

多克隆抗體的提取純化

壹、批量提取法

稱取DEAE-纖維素(DE32或DE52)50g,置於1000ml燒杯中,先以蒸餾水漂浮除去細顆粒,再經酸堿處理後,用0.01~0.05mol/L,pH8.0左右的磷酸鹽緩沖液(PB)平衡。將水分抽幹,或用布氏濾鬥(內放兩層濾紙)過濾,收集濕纖維素,以降低其離子強度。按1ml血清加濕重5g DEAE纖維素,經過充分攪拌,置4℃吸附1h。上清液可再如此處理壹次,即獲得較純的IgG。該法提取IgG簡便,既可小量提取,也可大量制備。

二、Tris-Cl離子交換層析法(Ion-exchange chromatography)

材料和試劑

1. DE32或DE52纖維素。

2. HCl;NaOH;0.01~0.05mol/L,pH8.0 PB;0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl;0.5mol/L NaCl。

3. 待純化標本:雜交瘤腹水或培養上清,免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。

4. 1.5×50cm 層析柱;透析袋;紫外分光光度計及其他透析和層析所需的試劑和器材。

操作步驟

1.DE52纖維素的處理:DE52經酸、堿處理,0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl平衡。

2. 裝柱:將層析柱固定於滴定架上,柱底墊壹圓形尼龍紗,出口接壹細塑料管並關閉出水。將浸泡於0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中,待DE52自然沈降3~5cm高時,吸除0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl,或松開出水口螺旋夾,控制流速1~2ml/min,同時連續加入DE52至所需高度。待DE52完全沈降後,柱面放壹圓形濾紙片。

3. 平衡:松開出水口螺旋夾,以0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl平衡,控制流速為15滴/min,待流出液與洗脫液之pH值達到壹致時,停止平衡。

4. 待提取樣品的準備:將蛋白裝入透析袋裏,置4℃冰箱,對0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析過夜。

5. 加樣、洗脫與收集:用吸管吸去柱面液體,以毛細吸管沿柱壁加入樣品,樣品體積相當於柱床體積的1%~2%,蛋白濃度為50~70mg。啟開出水口螺旋夾使樣品緩慢進入柱床內,並用少量洗脫液清洗柱壁;待液體進入柱床後,以0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl洗脫,控制流速為14~16滴/min。分部收集器收集,紫外監測,或人工收集,以紫外分光光度計分別測定每管280nm OD值,描繪洗脫液峰。

6. 濃縮:將洗脫液的280nm OD上峰段與下峰段各管分別合並,裝入透析袋,以PEG濃縮至所需體積。

三、Tris-PO4 離子交換層析法

該法在上述方法的基礎上稍加改良,即通過梯度洗脫,可用於血清中IgG和IgM的提取。

材料和試劑

1. DE32或DE52纖維素。

2. 待純化標本:雜交瘤腹水或培養上清,免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。

3. 1.5×50cm 層析柱;透析袋及其他透析和層析所需的試劑和器材。

4. 梯度洗脫液包括:0.005 mol/L,pH8.6 Tris-PO4 ;0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4 ;0.5mol/L,pH5.1 Tris-PO4 。

操作步驟

1. 蛋白標本對0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4 透析。

2. DE52裝柱,並以0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4 平衡。

3. 加樣,以0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4 洗脫,紫外監測直至洗脫液280nm OD回到基線。這壹步驟可除去血清中其他蛋白。

4. 以350ml 0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4 洗脫,這壹步驟可用於純化血清IgG和IgM。

5. 以125ml 0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4 和125ml 0.5mol/L,pH5.1 Tris-PO4 梯度洗脫,總量收集250ml;重復步驟(5)。

6. 根據280nm峰值合並蛋白峰,透析濃縮和保存同上。

用過的DE52可用0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl和0.5mol/L NaCl、0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl梯度洗脫回收。再用蒸餾水洗至中性,加入0.02%疊氮鈉於4℃保存備用。

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