RNA 提取流程
1. 樣品處理
從各種不同來源樣品(如細菌、酵母、血液、動物組織、植物組織和培養細胞),或同壹來源樣品的不同組織(如植物幼嫩葉片、成熟根、莖等)中提取高質量的RNA,因細胞結構及所含的成分不同,樣品預處理的方式也各有差異。
樣品的要求:
最好使用新鮮的樣品或取樣後立即在低溫(-20℃或-70℃)冷凍保存的樣品,避免反復凍融,因為這會導致提取的RNA降解和提取量下降。
樣品預處理方式:
植物材料-液氮研磨
動物材料-勻漿、液氮研磨
細菌-溶菌酶破壁
酵母-液氮研磨、玻璃珠處理、混合酶破壁
2. 細胞裂解
異硫氰酸胍/苯酚法(TRIZOL)
這是壹種傳統的RNA提取方法,適用於大部分動植物材料,但對於次生代謝產物較多的植物材料提取RNA效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復合體解離,並將RNA釋放到溶液中,采用酸性酚-氯仿混合液抽提,低PH值的酚將使RNA進入水相,而蛋白質和DNA仍留在有機相,從而可以完成RNA的提取工作。
該法應用非常廣泛,適用於包括動物組織、微生物、培養細胞等在內的各類動物性材料,同時還適用於次生代謝物較少的植物性材料,如幼苗、幼葉等。該法主要應用在動物組織和培養細胞的RNA提取中。
胍鹽/ β- 巰基乙醇法:
適用於各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料。
在這種方法中,胍鹽使細胞充分裂解,β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實驗全程中可以抑制RNaseA的活性,保護RNA不被降解。
我公司的“GREEN ”系列總RNA 提取試劑盒是基於這種方法開發的產品,分別適用於各類不同的材料。此系列產品的具體實驗步驟和適用範圍在實驗技術手冊中有詳細介紹,實驗者可根據自己的需要進行選擇。
其它方法:
有些植物材料多糖多酚含量較高,如植物果實,番茄的葉子等,有些植物木質化程度較高,如根莖等組織。針對這類材料本公司推出了壹種全新的植物總RNA提取試劑,該試劑特別適合於從富含多糖、多酚、澱粉的材料中提取純度高、完整性好的總RNA,有關的具體步驟將在分論中詳細介紹,實驗者可根據自己的需要進行選擇。
3. RNA 純化及獲得
純化要求
RNA樣品中不應存在對酶(如逆轉錄酶)有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的汙染。排除DNA分子的汙染。
純化方法及沈澱
方法壹:有機溶劑抽提法
氯仿抽提
在使用RNA提取試劑進行RNA提取時,常使用氯仿進行抽提,以去除蔗糖、蛋白等雜質,並促進水相與有機相的分離,從而達到純化RNA的方法。在本公司的提取RNA的產品中,與TRIzol同型試劑法及其衍生試劑盒。
沈澱
氯仿抽提RNA後,壹般采用了異丙醇或乙醇來沈澱水相RNA。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇,室溫沈澱20-30分鐘,高速離心,可獲得RNA沈澱。
洗滌沈澱
加入無RNase的75%乙醇,將RNA沈澱振蕩懸浮,使RNA沈澱中的鹽離子被充分溶解。然後再離心10-30分鐘。再次沈澱RNA。離心後,小心倒掉上清(註意不要倒出RNA沈澱),隨後快速離心1-2秒,將殘留在管壁上的乙醇手機到管底後,用小槍頭吸凈,超靜臺中風幹1-2分鐘(註意不要晾得太幹,否則RNA沈澱不易溶解)。
溶解沈澱
加入適量RNase-free ddH2O溶解RNA沈澱。
方法二:矽基質吸附法
隨著實驗方法的改進,現已發展出壹種采用吸附材料純化核酸的方法。目前較常見的有:矽基質吸附材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。矽基質吸附材料因其具有可特異吸附核酸,使用方便、快捷、不使用有毒溶劑如苯酚、氯仿等優點,成為核酸純化的首選。
本公司生產的總RNA提取試劑盒(ZP403-ZP407)和GREENspin系列總RNA提取試劑盒即采用矽基質吸附達到RNA分離純化目的,通過專壹結合RNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統,使樣品在高鹽條件下與矽膠膜特異結合,而蛋白、有機溶劑等雜質不能結合到膜上而被洗脫,鹽類則被含有乙醇的漂洗液洗滌,最後用RNase-free ddH2O將RNA從矽膠膜上洗脫下來。