無縫克隆，也稱為同源重組，可以將單個或多個片段同時插入到壹個載體中，而不需要重復的酶切和純化。通常無縫克隆可以在515 min內完成多個片段的連接，克隆陽性率高達98%。但需要註意的是，我們在無縫克隆前進行PCR擴增時，載體與片段之間，片段與片段之間需要有1520個堿基的同源序列。為什麽？因為我們無縫克隆的試劑盒裏有三種酶，分別是T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶。其中T5核酸的核酸外切酶具有5’3’核酸的核酸外切酶活性，可降解5’3’開始的序列。此時，載體和片段的3’同源序列暴露出來。堿基互補配對後，DNA聚合酶添加缺失的堿基，DNA連接酶將片段與載體連接，從而實現載體重組的功能。所以如果不添加同源序列，載體和片段，片段和片段就不會連接。