體積測量法:又稱菌絲體濃度測量法。
通過測量壹定體積培養基中所含菌絲的數量,可以反映微生物的生長狀況。方法是取壹定量的待測培養液(如10 ml)置於帶刻度的離心管中,設定壹定的離心時間(如5分鐘)和轉速(如5000 rpm),離心後倒出上清液,測得上清液體積為V,菌絲體濃度為(10-V)/65438。菌絲體濃度的測定是大規模工業發酵生產中微生物生長的重要監控指標。這種方法廣泛、簡單、快速,但需要設定壹致的處理條件,否則偏差會很大,因為離心沈澱中混有壹些固體營養物,結果會有些偏差。
稱重幹重法:
它可以通過離心或過濾來確定。壹般幹重是10-濕重的20%。離心法是將壹定體積待測培養液倒入離心管中,設定壹定的離心時間和轉速,離心,用清水離心洗滌1-5次,幹燥。幹燥可以通過烘箱在105℃或100℃進行,或通過紅外線,或通過真空幹燥在80℃或40℃進行,然後稱重。如果用過濾法,絲狀真菌可以用濾紙過濾,細菌可以用醋酸纖維素膜等濾膜過濾,過濾後用少量水沖洗,400℃真空幹燥,叫幹繁殖法比較復雜。通常,當獲得的微生物產物為菌體時,常采用這種方法,如活性幹酵母(ADY),壹些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。
濁度法:
微生物的生長導致培養物濁度增加。用紫外分光光度計測量某壹波長的光吸收值來判斷微生物的生長情況。壹個帶有側臂的特殊三角瓶可以用來定期跟蹤培養物中細菌的生長。將側臂插入光電比色計比色座的孔中,無需取菌液即可隨時測定其生長情況。這種方法主要用於監控發酵工業中細菌的生長。比如我用的是UNICO公司的紫外可見分光光度計,用比色管在波長600nm處定時測量發酵液的吸光度值OD600,來監測大腸桿菌的生長和誘導時間。
菌絲體長度的測量:
對於絲狀真菌和壹些放線菌,我們可以在培養基上測量壹定時間內菌絲生長的長度,或者用壹端開口、帶有刻度的細玻璃管,進入合適的培養基,躺下,在開口的壹端接種微生物,壹段時間後記錄菌絲生長的長度,從而測量絲狀微生物的生長情況。
微生物計數法
血細胞計數平板法:
血細胞計數板是壹種具有特殊結構尺度和厚度的厚玻璃板。載玻片上有四個凹槽和兩個脊,中央有壹個短的水平凹槽和兩個平臺。兩個脊的表面比兩個平臺的表面高0.1 mm。每個平臺上刻有不同規格的格子,中心0.1 mm2的面積上刻有400個小方塊。用油鏡觀察,統計某個大細胞中的微生物數量,就可以計算出1 ml菌液中所含的細菌數量。這種方法簡單、直觀、快速,但只適用於對單細胞微生物或絲狀微生物產生的孢子進行計數,結果是包括死細胞在內的細菌總數。
染色計數方法:
為了彌補某些微生物在油鏡下不易觀察計數,血細胞計數平板法無法直接區分死細胞和活細胞的不足,人們發明了染色計數法。借助不同的染料,在顯微鏡下可以更方便地計數活菌。例如,可以用亞甲藍染色液來計數酵母活細胞的數量。染色後,活細胞無色,死細胞藍色。
比例計數法:
將顆粒濃度已知的液體(如黴菌孢子或紅細胞)和待測細胞濃度的菌液按壹定比例均勻混合,在顯微鏡視野內通過計數各自的數量即可得到未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較廣泛。並且有必要制備具有已知顆粒濃度的懸浮液作為標準。
液體稀釋法:
未知細菌樣本被連續稀釋10倍。根據估算,從最合適的10倍連續三次稀釋中取5 ml樣本,接種於含***15培養基的三組試管中。培養後,記錄每個稀釋度下生長的試管數,然後求出最大概率表MPN(最可能數)。這種方法常用於檢測食品中的微生物,如飲用水和牛奶的微生物限度檢查。
平板菌落計數法:
這是最常用的活菌計數方法之壹。將待測菌液進行梯度稀釋,取壹定體積稀釋後的菌液在固化前與合適的固體培養基混合均勻,或將菌液塗布在固化後的固體培養基平板上。孵育後,原始細菌溶液的細菌計數可以通過將平板上出現的菌落數乘以細菌溶液的稀釋度來計算。壹般直徑9cm的平板上出現50-500個菌落。但方法比較麻煩,操作者需要熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得到菌液中的活菌數,而且可以壹次分離培養菌液中的細菌,得到單克隆。
試紙法:
在平板計數法的基礎上,開發了用於快速計數的小型商用產品。有小而厚的濾紙片,瓊脂片等。在濾紙和瓊脂上吸取合適的培養基,加入活性指示劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,無色)浸泡試驗菌液,然後在密封包裝袋中培養。短期培養後,濾紙上出現具有壹定密度的玫瑰色小菌落,對照標準紙色板上的光譜,即可估算出樣品的細菌含量。試紙計數法快速準確,避免了平板計數法的人為操作誤差。
薄膜過濾法:
用特制濾膜過濾壹定體積的含菌樣品,用橙色染色,在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光。活細胞會發出橙色熒光,而死細胞會發出綠色熒光。
生理指數法:
微生物的生長伴隨著壹系列生理指標的變化,如發酵液的pH、含氮量、含糖量、產氣量等。與生長量平行的生理指標有很多,可以作為生長測量的相對值。
氮含量的測定:
大多數細菌的含氮量為12.5%幹重,酵母為7.5%,黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25,可以確定粗蛋白的含量。測定氮含量的方法有很多,如硫酸消化法、高氯酸消化法、碘酸消化法、磷酸消化法和杜馬斯法測定N2氣體。杜馬斯測量N2氣體的方法是將樣品與CuO混合,在CO2氣流中加熱,產生氮氣,收集在呼吸計中,用KOH吸收CO2後測量N2的量。
碳含量的測定:
將少量生物材料(0.2-2.0 mg幹重)混合到1 ml水或無機緩沖液中,並與2 ml 2% K2Cr2O7溶液壹起在100℃下加熱30分鐘,然後冷卻。加水稀釋至5 ml,在580nm波長處讀取吸光度值,計算生長量。需要使用試劑作為空白對照,使用標準樣品作為標準曲線。
還原糖的測定:
還原糖通常指單糖或寡糖,可被微生物直接利用。還原糖的測定可以間接反映微生物的生長情況,常用於大規模工業發酵生產中微生物生長的常規監測。方法是:將發酵液離心,取上清液,加入費林試劑,沸水浴煮沸3分鐘,取出加少許鹽酸酸化,在接近終點時加入澱粉溶液,繼續加入Na2S2O3至終點,查表讀出還原糖含量。
氨基氮的測定:
方法是將發酵液離心,取上清液,加入甲基紅和鹽酸作為指示劑,加入0.02N NaOH調節顏色至顏色剛好褪色,加入18%中性甲醛作為底物,反應幾分鐘,加入0.02N變色,根據NaOH的量計算氨基氮的含量。根據培養基中氨基氮的含量,可以間接反映微生物的生長狀況。
其他生理物質的測定:
P、DNA、RNA、ATP、NAM(乙酰胞壁酸)的含量和其他指標,如產酸、產氣、產CO2(以標記葡萄糖為底物)、耗氧量、粘度和產熱,都可以用來確定生長。還可以根據反應前後底物濃度的變化、最終產氣量和微生物活性來反映微生物的生長情況。比如BMP-2的發酵生產,我總是通過監測溶解氧和pH值的變化來判斷細菌的生長情況。
商業化快速微生物檢測方法;
微生物檢測的發展方向是快速、準確、簡便和自動化。目前,許多生物制品公司利用傳統的微生物檢測原理,結合不同的檢測方法,設計出各種類型的微生物檢測儀器和設備,逐漸廣泛應用於醫學微生物檢測和科學研究中。例如:
1、抗幹擾培養基和快速微生物數量檢測技術的結合,解決了傳統微生物檢測方法無法解決的問題,為建立完整的抗幹擾微生物檢測體系奠定了堅實的基礎。抗幹擾微生物培養基、新型生化鑒定管、微生物計數卡、環境質量檢測試劑盒等。由中科院廣州分院合作工業部提供,可方便地用於多種測試。
2.BACTOMETER的全自動細菌總數和快速細菌檢測系統可在數小時內獲得監測結果,樣本的顏色和光學特性不影響讀數。對酵母菌和黴菌檢測同樣高靈敏度的原理是通過阻抗技術將待測樣品和培養基放入反應試劑盒中,底部有壹對不銹鋼電極,測量微生物生長引起的阻抗變化。例如,當微生物生長時,培養基中的大量營養物質可以通過代謝轉化為活性小分子,這種微弱的變化可以用電阻抗法檢測,這樣就可以比傳統的平板法更快地監測微生物的存在和數量。測定項目包括細菌總數、酵母菌、大腸桿菌、黴菌、乳酸菌、嗜熱菌、革蘭氏陰性菌、金黃色葡萄球菌等。