血清學反應的原理是人或高等動物對壹些侵入自身的外來物質產生免疫反應，即刺激淋巴組織產生相應球蛋白的外來物質稱為抗體，能刺激機體產生抗體的外來物質稱為抗原。抗原及其相應的抗體能在體內或體外發生特異性反應，可用於預防疾病(人或動物)和識別檢測病原體。
抗原的分子中有許多化學活性基團，稱為抗原決定簇，它們的結構決定了抗原的特異性。壹般來說，抗原決定簇數量越多，抗原性越強。植物病毒是壹種核蛋白，其外殼由許多亞單位組成，抗原決定簇位於亞單位上。植物病毒是壹種很好的抗原，它的蛋白質外殼，尤其是外殼表面，起著抗原的作用；單鏈核酸雖然不能作為抗原，但與外殼蛋白同時存在時，可以增強動物體內對外殼的免疫反應。壹般來說，植物病毒比其宿主的正常植物蛋白具有更強的抗原性。
抗體是動物機體免疫活性細胞受抗原刺激後產生的免疫球蛋白，通常用“ig”表示。抗體中至少有五種免疫球蛋白，分別是IgG、IgM、IgD和IgE，其中IgG最為重要，約占70% ~ 90%。IgG是壹種靈活的Y形分子。由四條2-硫鏈連接的四條多肽鏈(兩條重鏈和兩條輕鏈)組成。鏈的壹端是氨基端，另壹端是羧基端。這種酶能把IgG降解成碎片。木瓜蛋白酶和胃蛋白酶是常用的。前者將IgG降解為Fab和Fc片段；後者降解成兩個片段，F(ab)2和FC。Fab片段具有抗體活性，1 fab結合1抗原分子。F(ab)2是壹種二聚體，可以結合兩個抗原分子。抗體存在於免疫動物的血清或體液中。
植物病毒抗血清以病毒的純化溶液為抗原，以兔，有時以小鼠或母雞為免疫動物，通過靜脈、肌肉或腹腔逐漸加大劑量，多次註射抗原。抗體產生後，收集血液並取出其血清作為病毒的抗血清。免疫家兔產生的抗血清稱為兔抗體；免疫小鼠產生含有特異性抗體的腹水，收集的腹水中含有“腹水抗體”；對母雞進行免疫以生產含有抗體的雞蛋。從卵黃中提取的抗體稱為“卵黃抗體”。利用細胞融合技術，將小鼠骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞雜交，產生雜交瘤細胞，該細胞具有較強的增殖能力，可在體外連續培養產生抗體。選擇能產生單壹抗體的細胞株，產生的抗體稱為“單克隆抗體”。單克隆抗體開創了動物體外抗體生產的新時代。
這裏介紹幾種常用的血清學檢測技術。
1免疫雙擴散法
又稱奧斯威辛瓊脂雙擴散法。瓊脂加熱後溶於水，冷卻後成為凝膠板。在上面打幾個孔，抗原和抗體分別放入凝膠中，它們分別擴散到凝膠中，在抗原抗體比例最佳的位置形成沈澱反應。
具體步驟如下:每1~2g(壹般為1 ~ 2g)瓊脂粉在沸水浴或家用高壓鍋中溶解於100ml生理鹽水中，制成1% ~ 2%瓊脂，加入0.1%疊氮化鈉防腐，使用吸管或家用高壓鍋。測試時，在瓊脂平板上放壹張“孔排列圖”，用打孔機按圖案打孔。孔的排列方式有很多種，比如梅花，7孔，即中間1孔，周圍6孔；有5個孔的正方形地層，即中間的1孔和周圍的4個孔(圖1)。打孔後，用針或吸引器取出孔內的凝膠盤，向孔內加入適當稀釋的抗原或抗體。抗原孔應包括已知的陽性抗原、待測抗原和健康毒株對照，可使用健康毒株的汁液或純化的病毒溶液。填滿所有的洞，放在加濕器裏幾個小時或直到第二天，觀察黑色背景的散射光或斜射光上方的降水線。合適的抗原抗體濃度是影響反應結果的主要因素，必須註意:首先孔徑和相鄰兩孔之間的距離(相鄰兩孔之間的最短距離)要合適，兩者之比為2∶1，即孔間距等於孔半徑，如果孔間距過大，沈澱線不會出現或變模糊，反應時間延長，不能很快看到結果；第二，掌握反應物的最佳濃度。為此，將所用的抗體或抗原稀釋兩次，並在正式反應前測定兩種反應的最佳濃度。
圖1打孔模式
免疫雙擴散試驗可用於鑒別抗原和抗體是否具有特異性，以及確定兩種抗原是否相同。抗原和抗體之間的沈澱線表明抗原和抗體是特異性相關的。參見圖2。
圖2抗原和抗體之間的沈澱反應
如果TMV抗血清與壹種未知的感病物質的汁液發生反應，說明該感病物質含有TMV。
比較兩種抗原是否相同，有三種情況(圖3): ①抗原相同:A抗原和A抗體形成特定的沈澱線，相鄰的B抗原也形成沈澱線，兩條線連成壹條，說明A、B抗原相同。②抗原部分相同:雖然A抗原和B抗原都有沈澱線，但兩條線呈樹枝狀相連，說明B抗原的沈澱線只與A抗原相連，說明兩種抗原只有部分相同。③抗原不同:A、B抗原的沈澱線交叉，說明其抗原性完全不同。
圖3抗原和抗體之間的沈澱反應用於比較兩種抗原。
免疫雙擴散實驗已廣泛應用於植物病毒的鑒定和檢測、病毒間親緣關系的研究以及抗體效價的測定。具有操作簡單、省時、省樣、鑒別能力強的優點，特別適用於球形和桿狀病毒。長線病毒容易凝集，在瓊脂中不易擴散。需要在反應前加入SDS降解病毒顆粒，以獲得更好的結果。
2免疫電泳
免疫電泳是壹種結合免疫擴散和電泳的實驗技術。成分復雜的抗原可以通過不同的電荷和遊泳速度來分離，從而增加識別能力。常用的方法有對流免疫電泳和平板電泳。
對流免疫電泳是抗原和抗體的相對排列(圖4)。當置於壹定的電場中，以堿性緩沖液為電解質時，抗原比抗體帶更多的負電荷，因此抗原向正極移動。雖然抗體也有微弱的向正極移動的力，但在強電滲作用下，向負極輕微移動。在電場的作用下，遊泳約15min後，兩者之間可出現沈澱線。對流免疫電泳比瓊脂雙擴散快，適合大量樣品的快速檢測。
流動免疫電泳抗原抗體排列圖。
具體步驟:用0.025mol/L硼酸緩沖液(pH8.6)或0.05mol/L TrisM緩沖液(含EDTA)配制1% ~ 1.2%瓊脂，鋪平板，排列抗原抗體。抗原和抗體之間的孔間距與孔的直徑相同，抗原和抗原(抗體和抗體)之間的孔間距等於孔的半徑。測定時，需將已知陽性抗原溶液設為陽性，健康原液設為陰性對照。將瓊脂平板置於電泳槽中，向槽中加入緩沖液，用濾紙將平板兩端與槽中的緩沖液連接。10 ~ 12 V/cm，電泳20 ~ 30 min，觀察結果。
平板免疫電泳是將抗原在瓊脂平板上電泳分離其不同成分，然後進行免疫雙擴散反應。具體步驟:在瓊脂平板上打抗原孔，放入待測抗原、陽性和健康對照。10 ~ 1~2h/cm電泳1~2h，取出，按圖5在兩個抗原孔之間挖壹個寬約2mm的溝，溝間距與孔徑相同。罐子裏裝滿了抗血清。把它平放在保濕容器中，過夜，觀察結果。
圖5血小板免疫電泳抗原抗體排列圖
酶聯免疫吸附試驗
(ELISA)酶聯免疫吸附試驗簡稱“酶聯”。靈敏度高，可檢測微量抗原，適合檢測大量樣本，可用於定性定量分析。原理是用酶標記的抗體(或抗原)與其抗原(或抗體)結合時，酶作用於底物產生顏色，通過顏色的深淺可以判斷抗體是否與抗原反應及其濃度。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)在其應用中衍生出許多不同的方法。
在應用酶聯檢測前，應做好提取純免疫球蛋白(IgG)、制備酶標抗體和制備底物的準備工作。
3.1γ-球蛋白的提取和IgG的分離
介紹硫酸銨沈澱法，步驟如下:
向抗血清中加入等體積的生理鹽水，搖勻，加入等體積的飽和硫酸銨溶液(邊攪拌邊滴加)，4℃靜置65438±0h，低溫4000r/min離心30min。靜置沈澱，加入少量生理鹽水溶解沈澱，置於4℃冰箱透析袋中，用0.01mol/L PBS(pH7.5)透析數次，至試驗中無NH4+和SO42-為止，低溫4000r/min離心15min。棄去沈澱，得到γ-球蛋白。
分離IgG，用DEAE-纖維素柱層析，包括以下步驟:
將DEAE-纖維素(6 ~ 8g)置於燒杯中，用蒸餾水攪拌，靜置30 ~ 45min，用1mol/L NaOH洗滌-蒸餾水洗滌-1mol/L HC 1洗滌-蒸餾水洗滌-1mol/L NaOH洗滌PBS溶液洗滌。將純化的DEAE-纖維素裝入柱中(柱長30cm，直徑1 ~ 2cm)，用蒸餾水洗滌柱，然後用0.01mol/LPBS(pH7.2)洗滌，直到pH達到7.2。將量筒放平，吸出多余的PBS，只留2mm深的液面，加入丙種球蛋白溶液，打開色譜柱下端的開關，當液面距離量筒2mm時，加入1ml 0.1mol/L PBS(pH 7.5)，重復1次。當緩沖液尚未流入色譜柱時，色譜柱。收集主管洗脫液，用10%磺基水楊酸測定每管是否有IgG。合並含IgG的試管溶液，測定IgG濃度，然後冷藏備用。
3.2酶標抗體的制備
酶標抗體的制備是將酶和IgG結合成穩定的酶標抗體結合物。應選擇分子量小、活性強、純度高、價格低的酶進行制備，常用的有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。
酶標抗體活性的保留期因濃度和保存方法而異。稀釋液(1∶10)存放時間短，壹般在12h內用完。濃縮液在低溫下可保持活性1個月以上，因此可保存數周。濃縮液可以通過冷凍幹燥保存，並無限期地保持其活性。酶標抗體可以是某種病毒的特異性酶標抗體，也可以是羊抗兔的酶標抗體。目前試劑公司都有酶標抗體出售。
3.3雙抗體夾心酶聯技術
雙抗體夾心法因其檢測靈敏度高、檢測結果準確而被廣泛應用於病毒檢測。
實驗步驟如下:
用包被緩沖液(0.1mol/L碳酸鈉緩沖液，PH9.5)將包被特異性抗體的(1 ~ 10g/ml)IgG稀釋至1 ~ 10g/ml，在酶聯反應板的每個孔中加入200μl，37℃孵育2h，4℃過夜，包被孔中的IgG。
(2)用洗滌液(0.02mol/L PBS pH7.2，含0.5%吐溫-20，0.1%牛白蛋白)洗去包被後多余的IgG，洗滌3次。
(3)加入待測抗原，同時設置已知陽性、陰性和空白對照。由於反應板各孔的邊際效應，結果不穩定，所以壹般設置側排為空白對照，37℃孵育2小時。
(4)洗滌同(2)。
(5) ELISA抗體IgG可以是特異性抗體或羊抗兔ELISA抗體，37℃孵育2h。
(6)洗滌同(2)。
(7)加入底物，37℃孵育65438±0h。
(8)添加終止解決方案。每孔加入3mol/L NaOH或2mol/L H2SO4 50μl以終止反應。
(9)讀取測試結果，並在酶聯檢測器中測量反應溶液的光密度。所使用的波長根據基底而變化。鄰苯二胺底物，在492nm波長下測定；山莨菪堿的測定波長為405nm。當光密度大於或等於陰性對照的2倍時，判定為陽性。沒有分光光度計的時候，可以用肉眼判斷。與空白和陰性對照相比，黃色為陽性。顏色越深，陽性越強，可以用+、++、++來表示。空白和陰性無黃色表明實驗結果可靠。
3.4間接酶聯技術
這種方法利用特異性抗體和羊抗兔(或羊抗鼠)酶聯反應，省去了制備酶聯抗體的繁瑣工作，因此更簡單、更經濟。步驟如下:
3.5直接酶聯技術
用特異性酶標抗體檢測抗原的方法。步驟如下: