原位雜交(ISH)是壹種將細胞或組織中的特定DNA或RNA分子可視化的分子技術。ISH基於DNA/DNA或DNA/RNA雙鏈的互補性,將標記的核酸探針原位雜交到靶上。這樣,我們可以獲得有用的空間信息。
FISH是檢測微生物、診斷實體瘤和血液腫瘤以及指導癌癥治療的有效臨床工具。例如,FISH通常用於檢測BCR-ABL 1t(9;22)易位和各種癌癥中的許多融合基因。FISH還用於證實乳腺癌中HER2基因的擴增,從而確定最有可能從抗HER2單克隆抗體曲妥珠單抗中獲益的患者。另壹個重要的例子是非小細胞肺癌中EML4-ALK融合基因的檢測。隨著越來越多的免疫療法被開發和批準,研究人員試圖使用FISH來預測癌癥免疫療法的反應性。為了擴大FISH的有效性,我們可以將FISH與IHC或IF結合,同時檢測不同細胞類型的RNA和蛋白質,從而更好地表征腫瘤微環境(TME)。
為了解決傳統FISH的局限性,研究人員從研究DNA轉向研究單分子RNA,並采用了高通的方法,從而產生了smFISH技術,該技術可以可視化和量化單個mRNA分子,並表征內源基因表達的空間模式。通過靶向細胞mRNA而不是DNA分子,SmFISH已經成為評估腫瘤轉錄異質性的有力工具。
RNAscope是壹項基於ISH的商業技術,可以檢測多達12種不同的RNA靶標,可以很容易地與IHC和/或IF結合,以自動化的方式同時研究RNA和蛋白質。相比fish其他基於FISH的技術,RNAscope設計了超過13000個RNA探針,並通過商業流程進行了驗證。因此,對於基礎研究和臨床實驗來說,這是壹種省時、友好的方法。RNAscope已經廣泛應用於各個學科,包括傳染病、癌癥、免疫治療、炎癥和神經科學。特別是,它是IHC的有力替代物,可以評估各種實體瘤中免疫檢查點的表達,如PD-L1。通過檢測特定的RNA,RNAscope闡明了TME、免疫逃逸機制以及預測和預報癌癥的新生物標誌物。
在免疫治療的背景下,RNAscope在理解CAR-T細胞治療中發揮了有價值的作用。RNAscope已被用於評估靶基因表達的特異性和追蹤異種移植小鼠模型中CAR-T細胞的分布。延伸到人類樣本,研究已經證實BCMA的表達是多發性骨髓瘤CAR-T細胞免疫療法的靶點。
雖然RNAscope和其他技術可以獲得更高的靈敏度和特異性,但需要基於fFISHh的技術來允許高通轉錄組分析更好地表征顯示獨特基因表達譜的罕見細胞群和細胞類型。MERFISH和seqFISH不僅提供了改進的RNA定量、信號擴增和檢測,還提供了基於圖像的轉錄組分析。
MERFISH由smFISH改進而來,采用基於條形碼的組合標記方法,然後進行多輪雜交,保證熒光信號的高亮度和壹次可檢測的大量RNA。
SeqFISH是另壹種基於壹系列條形碼雜交的多重smFISH技術。例如,seqFISH用於檢測小鼠胚胎幹細胞和腦組織>:用10000 mRNA成像具有高準確度和分辨率。相關研究證明,seqFISH是研究和獲取T細胞成熟過程中調控基因動態表達的有力工具。另壹項研究將微流控技術與倍增Smfish技術相結合,研究乳腺癌中的腫瘤異質性,證明倍增Smfish可以從不同角度進壹步優化。
盡管smFISH技術前景廣闊,但由於探針設計、驗證、圖像分析和解碼的復雜性,基於smFISH的復合技術尚未在轉化研究或臨床應用中得到廣泛應用。通常使用非多重FISH、定量PCR、IHC和IF在mRNA或蛋白水平研究單個基因的表達更方便,特別是當研究的基因數量很少時,如壹組預後標記。另壹個限制是,由於序列雜交的性質,總成像時間至少為18小時,不包括36 ~ 48小時的初始探針雜交時間,因此整體吞吐量低於其他技術(如DSP和Visium)。再說復用?SmFISH技術只能評估新鮮冷凍組織中的壹種分析物,如RNA。DSP等新興技術可以評估新鮮冷凍組織和病理學中常用的標準福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織中的蛋白質和RNA。
DSP是壹種高復雜度的空間分析方法,它克服了多路smFISH技術的主要限制。DSP使用寡核苷酸檢測技術來定量FFPE組織樣本中的蛋白質或RNA。
與序列雜交技術(如MERFISH)不同,DSP提供了更高效的工作流程,可以在48小時內從10~20個組織切片或多達384個靶區產生結果。另外,與只分析RNA的多路smFISH相比,DSP可以同時檢測96種蛋白質或1400 mRNA。這壹特征與癌癥免疫治療特別相關,因為mRNA和蛋白質表達模式的差異可用於闡明轉錄後調節和翻譯後修飾,這導致蛋白質不穩定並影響預後和治療反應。同時,DSP還保留了組織樣本的完整性,可以存儲珍貴的樣本,以供將來進壹步分析。
DSP廣泛應用於免疫治療領域。例如,DSP已被用於評估接受化療的彌漫性大B細胞淋巴瘤患者的免疫微環境。DSP也有免疫檢查點封閉療法的研究,包括抗PD-L1和抗PD-1療法。DSP可用作輔助診斷工具,以標準化、定量和客觀地評估TME空間限定區域中PD-L1蛋白的表達。在另壹項研究中,DSP成功識別了20多種生物標誌物,可以預測黑色素瘤患者對免疫療法的反應。
在單細胞RNA測序過程中,由於組織通常被勻漿以獲得轉錄組的平均輪廓,因此空間信息丟失。最近發展了空間轉錄組學技術,利用空間條形碼寡脫氧胸腺嘧啶微陣列實現完整組織切片中轉錄組的定量可視化和分析。
這項新技術首先在小鼠嗅球上得到證明,並遵循以下標準工作流程:組織切片、固定、蘇木精和曙紅(H & amp;e)染色、明視野成像、組織浸潤、cDNA合成、組織切除、探針釋放、文庫制備、測序、數據處理、數據可視化和分析。
通過st對乳腺癌、前列腺癌和皮膚惡性黑色素瘤活檢的數據分析表明,腫瘤內部和腫瘤之間的異質性達到了前所未有的程度,通過RNA測序分析和/或標準形態學註釋,腫瘤區域和外圍的基因表達譜存在明顯差異。此外,使用該技術的體內實驗發現,IL-6信號是由小膠質細胞的再生誘導的,這在治療中可能是有價值的。
為了利用ST的潛力,研究人員最近開發了壹種稱為MIA的分析方法,該方法整合了單細胞RNA測序和ST技術產生的數據集,以定位組織特定區域的細胞。作為概念的證明,MIA在胰腺導管腺癌的數據集上進行,並揭示了在空間受限區域中特定細胞類型和亞群的富集,這些細胞類型和亞群在以前是未知的或不可檢測的。
基於空間轉錄的概念,10× Genomics發布了Visum空間基因表達解決方案。與st技術第壹次叠代相比,分辨率更高,靈敏度更高。可用於組織結構和功能相關疾病的深入研究,不僅可用於癌癥免疫治療,還可用於神經系統疾病。
雖然轉錄空間分析技術相對較新,但它已在腫瘤免疫治療中得到廣泛探索。FISH和RNAscope是診斷和預測實體腫瘤和血液腫瘤的有效臨床工具。較新的技術,如MERFISH和Visium,以前所未有的分辨率和靈敏度實現了批量轉錄組分析。隨著這項技術的日益普及,可以發現新的生物標誌物來預測免疫治療的反應,並根據其獨特TME的異質性進行個性化治療。這些空間分析技術也可以與降維技術相結合,例如,UMAP用於可視化TME的免疫景觀。
展望未來,DSP提供了mRNA表達的空間分析和數字表征,但仍然受到可同時研究的基因靶標數量的限制。雖然Visium在市場上相對較新,但它在短時間內得到了不斷的改進,在疾病病理學研究和臨床轉化方面具有巨大的潛力。
研究人員可以利用各種發展中的空間轉錄組技術。重要的是不僅要考慮技術特征,包括空間分辨率、靈敏度、特異性和組織類型,還要考慮實際因素,如成本、與現有資源的兼容性和周轉時間。研究人員必須仔細考慮他們的研究問題,並選擇與其研究和臨床目標密切相關的適當技術。
首發公眾號:國家基因庫大數據平臺
參考
張春林,等.腫瘤組織的基因表達譜分析在腫瘤免疫治療中的應用[J].中國腫瘤科學出版社,2002 .癌癥,2020,12(9): 2572。