稀鹽和緩沖體系的水溶液是提取蛋白質最常用的溶劑，因為它們對蛋白質的穩定性好，溶解度高。通常用量為原料體積的65，438+0-5倍。提取時需要均勻攪拌，以利於蛋白質的溶解。提取溫度取決於有效成分的性質。壹方面，大部分蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增加，因此高溫有利於溶解，縮短了提取時間。另壹方面，溫度升高，蛋白質會變性失活。所以基於這壹點，蛋白質和酶的提取壹般都是在低溫下(5℃以下)進行的。為了避免蛋白質提取過程中的降解，可以加入蛋白酶抑制劑(如氟磷酸二異丙酯和碘乙酸)。
下面重點介紹提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1，pH值
蛋白質，酶是兩性電解質，有等電點，提取液的pH值要選在等電點兩側的pH值。
範圍。用稀酸或稀堿提取時，要防止蛋白質可解離基團因過酸或過堿而發生變化，導致蛋白質構象發生不可逆的變化。壹般來說，堿性蛋白用微酸性提取液提取，酸性蛋白用微堿性提取液提取。
2.含鹽濃度
稀釋濃縮可以促進蛋白質的溶解，稱為鹽溶解。同時，由於鹽離子與蛋白質結合，稀鹽溶液具有保護蛋白質不變性的優點。所以在提取液中加入少量中性鹽如NaCl，濃度壹般為0.1.5 mol L，緩沖液通常為0.02-0.05M的磷酸鹽和碳酸鹽。
(2)有機溶劑萃取法
壹些與脂質緊密結合或分子中含有更多非極性側鏈的蛋白質和酶不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿。可以使用有機溶劑，如乙醇、丙酮和丁醇。它們具有壹定的親水性和較強的親油性，是脂蛋白的理想提取溶液。然而，它們必須在低溫下操作。丁醇提取方法特別有利於提取壹些與脂質緊密結合的蛋白質和酶。首先，丁醇具有很強的親油性，尤其是對溶解而言。第二，丁醇具有親水性，在溶解度範圍內(10%和40℃的度為6.6%)不會引起酶的變性和失活。此外，丁醇提取方法具有較寬的pH和溫度範圍，並且也適用於動物、植物和微生物材料。
二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法有很多種，主要包括:
(壹)根據蛋白質溶解度不同的分離方法。
1，蛋白質鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解性有顯著影響。壹般在低鹽濃度下，隨著鹽濃度的增加，蛋白質的溶解度增加，稱為鹽溶。當鹽濃度繼續增加時，蛋白質的溶解度不同程度地降低，並相繼沈澱。這種現象被稱為鹽析。當蛋白質溶液中加入大量的鹽時，高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO4和NH4)具有很強的水合力，可以抓住蛋白質分子的水合層，使其“脫水”，於是蛋白質膠粒凝結沈澱。鹽析時，溶液pH在蛋白質等電點時效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒，
影響鹽析的因素有:(1)溫度:蛋白質對溫度比較敏感，壹般可以在室溫下操作。壹般來說，蛋白質的溶解度在低溫下會降低，但壹些蛋白質(如血紅蛋白、肌紅蛋白和白蛋白)在較高溫度(25度)下的溶解度低於0度。更容易鹽析。(2)pH值:大部分蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中溶解度最低。(3)蛋白質濃度:當蛋白質濃度較高時，待分離的蛋白質往往與其他蛋白質場所壹起沈澱(* * *沈澱現象)。所以鹽析前要用等量的生理鹽水稀釋血清，使蛋白質含量達到2.5-3.0%。
蛋白質鹽析中常用的中性鹽主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉和磷酸鈉。
應用最廣泛的硫酸銨具有溫度系數低、溶解度高的優點(25℃時飽和溶液為4.1M，即767g/L；0℃時的飽和溶解度為3.9M，即676 g/L)。在這個溶解度範圍內，許多蛋白質和酶可以鹽析出來。此外，硫酸銨的階段性鹽析效果優於其他鹽類，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH值通常在4.5-5.5之間，用其他pH值鹽析時，需要用硫酸或氨水調節。
蛋白質經過鹽析和沈澱分離後，需要將鹽從蛋白質中去除。通常的方法是透析，即將蛋白質溶液裝入袋中進行分析(通常是玻璃紙)，用緩沖液透析，並不斷更換緩沖液。因為透析需要的時間比較長，所以最好在低溫下進行。此外，它還可以用於通過將葡萄糖凝膠G-25或G-50通過柱來去除鹽，這需要很短的時間。
2、等電點沈澱法
蛋白質處於靜電狀態時，粒子間的靜電斥力最小，所以溶解度最小。各種蛋白質的等電點不同。可以通過調節溶液的pH值達到壹種蛋白質的等電點來沈澱，但這種方法很少單獨使用，可以和鹽析法結合使用。
3.低溫有機溶劑沈澱法
使用與水混溶的有機溶劑，如甲醇、乙醇或丙酮，可以降低大多數蛋白質的溶解度並使其沈澱。這種方法的分辨率比鹽析法高，但蛋白質容易變性，應在低溫下進行。
(2)根據蛋白質分子大小不同的分離方法。
1，透析和超濾
透析是利用半透膜分離不同分子大小的蛋白質。
超濾法是利用高壓或離心力迫使水和其他溶質小分子通過半透膜，而蛋白質則留在膜上。可以選擇不同孔徑的濾膜來截留不同分子量的蛋白質。
2.凝膠過濾法
也稱為分子排阻色譜法或分子篩色譜法，是根據分子大小分離蛋白質混合物的最有效方法之壹。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex
Ged)和瓊脂糖凝膠。
(3)根據蛋白質的帶電性質進行分離。
蛋白質在不同的pH環境中，具有不同的帶電性質和電荷，因此可以分離。
1，電泳
在相同的pH條件下，由於分子量和電荷不同，各種蛋白質在電場中的遷移率不同，因此可以分離。值得註意的是等電聚焦電泳，它使用壹種兩性電解質作為載體。電泳時，兩性電解質從正極到負極形成逐漸增大的pH梯度，當帶有壹定電荷的蛋白質在其中遊動時，其等電點處的pH位置停止。該方法可用於分析和制備各種蛋白質。
2.離子交換色譜法
離子交換劑包括陽離子交換劑(如羧甲基纖維素；CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素；DEAE？字體
FACE = "éé"
LANG = " ZH-CN " & gt；纖維素)，當分離出的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，與離子交換劑電荷相反的蛋白質被吸附在離子交換劑上，然後通過改變pH或離子強度將吸附的蛋白質洗脫下來(詳見層析技術章節)。
(4)親和層析，壹種基於配體特異性的分離方法。
親和層析
色譜法)是壹種非常有效的分離蛋白質的方法。從非常復雜的蛋白質混合物中分離出某種要純化的蛋白質通常只需要壹個步驟。而且純度很高。這種方法是基於這樣壹個事實，即某些蛋白質可以與另壹種稱為配體的分子特異性結合，而不是與* * *。其基本原理是:蛋白質以復雜混合物的形式存在於組織或細胞中，而每種類型的細胞都含有成千上萬種不同的蛋白質，因此蛋白質被分離和純化。
表征是生物化學的重要組成部分。到目前為止，還沒有壹種單壹的或現成的方法可以從復雜的混合蛋白質中提取任何壹種蛋白質，因此常常是幾種方法聯合使用。
細胞分裂
1.高速組織搗碎:將材料調制成稀糊狀，放入容積約為1/3的缸中，蓋緊缸蓋，先將調速器調到最慢位置，再打開開關，逐漸加速到所需速度。這種方法適用於動物內臟、植物肉質種子等。
2.用玻璃勻漿器勻漿:首先將切好的組織放入試管中，然後放入研磨棒中來回研磨，上下移動研磨細胞。該方法比高速組織搗碎器具有更高的細胞破碎程度，並且適用於少量的動物器官和組織。
3.超聲波處理法:用壹定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞劇烈振動而破裂。這種方法最適用於微生物材料。大腸桿菌制備各種酶，常選擇50-100 mg菌/ml的濃度，頻率為1KG至10KG。
4.反復凍融法:將細胞冷凍在-20℃以下，室溫融化，反復數次。由於細胞中冰粒的形成和殘留細胞液中鹽濃度的增加，它們膨脹並破壞細胞結構。
5.化學治療:某些動物細胞，如腫瘤細胞，可被十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可使用溶菌酶進行更好的治療。
無論采用哪種方法破碎組織和細胞，細胞內的蛋白質或核酸水解酶都會釋放到溶液中，導致大分子的生物降解，造成天然產物的減少。加入氟磷酸二異丙酯(DFP)可以抑制或減緩自溶。加入碘乙酸可以抑制活性中心需要疏水基團的蛋白水解酶的活性，加入苯甲基磺酰氟(PMSF)也可以去除蛋白水解脆片的活性，但不是全部。通過選擇pH、溫度和離子強度，這些條件應該適合於目標物質的提取。
濃縮、幹燥和保存
壹、樣品濃度
在生物大分子的制備過程中，樣品由於柱純化而變得很稀，為了保存和鑒定往往需要濃縮。常見的濃縮方法有:
1，減壓、加熱、蒸發和濃縮
通過降低表面壓力來降低液體的沸點。減壓的真空度越高，液體的沸點越低，蒸發越快。該方法適用於某些熱不穩定生物大分子的濃縮。
2、氣流蒸發濃度
空氣的流動可以加速液體的蒸發，使其擴散成薄薄的壹層溶液，表面不斷地通過氣流；或者將生物大分子溶液裝入透析袋中放入冷室中，用電風扇吹風，使滲透膜外的溶劑不會蒸發，從而達到濃縮的目的。這種方法濃縮速度慢，不適合大量溶液的濃縮。
3.凝固法
生物大分子在低溫下形成冰，鹽和生物大分子停留在液相，沒有進入冰中。操作時，待濃縮的溶液冷卻成固體，然後慢慢融化，利用溶劑和溶質熔點的差異，除去大部分溶劑。比如用這種方法濃縮蛋白質和酶的鹽溶液時，不含蛋白質和酶的純冰晶漂浮在液面上，而蛋白質和酶則濃縮在下層溶液中，除去上層冰塊，這樣就可以得到蛋白質和。
4.吸收法
溶液中的溶液分子被吸收劑直接除去，使其濃縮。所用的吸收劑必須與溶液不發生化學反應，不吸附生物大分子，容易與溶液分離。常用的吸附劑包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和凝膠。使用聚乙二醇吸收劑時，應先將生物大分子溶液裝入半透膜袋中，然後在4度蓋上聚乙二醇，袋中的溶劑會被聚乙二醇迅速吸收。當聚乙二醇被水飽和時，應更換新的。
5.超濾法
超濾是利用特殊的膜選擇性過濾溶液中各種溶質分子的方法。當在壹定壓力(氮氣壓力或真空泵壓力)下沒有液體通過膜時，溶劑和小分子滲透，大分子被阻擋和截留。這是近年來發展起來的壹種新方法，最適用於生物大分子特別是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，具有成本低、操作方便、條件溫和等優點，並能較好地保持生物大分子的活性。回收率高。超濾法應用的關鍵在於膜的選擇。不同類型和規格的膜有不同的參數，如水流量、分子量截止值(即壹般情況下膜能截留的分子的最小分子量)，必須根據工作的需要來選擇。此外，超濾裝置的形式、溶質的組成和性質、溶液濃度等。都對超濾效果有壹定的影響。迪亞弗洛
超濾膜的分子量截止值:
膜名稱分子量截止值大平均孔徑
XM-30030000140
XM-200100，00055
XM-5050，00030
PM-30 30，00022
UM-2020，00018
PM-1010，00015
UM-21，00012
UM05500 10
中空纖維管由上述超濾膜制成，並且這些管中的許多聚集成束。管的兩端連接有低離子強度的緩沖溶液，使得緩沖溶液可以在管中連續流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖溶液流過纖維管時，小分子很容易擴散通過膜，而大分子則不能。這就是纖維過濾分析法，由於透析面積的增加，使透析時間縮短了65，438+00。
第二，烘幹
為了防止變質和便於保存，由生物大分子制備產品往往需要幹燥處理，最常用的方法是冷凍幹燥和真空幹燥。真空幹燥適用於不耐高溫、易氧化的物質的幹燥和保存。整個裝置包括幹燥器、冷凝器和真空幹燥原理，同時增加了溫度系數。在相同的壓力下，水蒸氣的壓力隨著溫度的下降而降低，所以在低溫低壓下，冰很容易升華成氣體。在操作中，通常將待幹燥的液體冷凍到冰點以下使其成為固體，然後在低溫低壓下將溶劑轉化為氣體以除去。幹燥後的產品疏松、溶解性好、結構自然，適用於各種生物大分子的幹燥和保存。
第三，存儲
生物大分子的穩定性與保存方法密切相關。幹燥後的產品壹般比較穩定，在低溫下幾天甚至幾年其活性都不會發生明顯變化。儲存要求很簡單，只要將幹燥後的樣品密封在幹燥器(充滿幹燥劑)中，保存在0-4度的冰箱中即可。以液態儲存時，應註意以下幾點。
1，樣品不能太稀，必須濃縮到壹定濃度後才能包裝保存。太稀的樣品容易使生物大分子變性。
2.壹般需要添加防腐劑和穩定劑。常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、麝香草酚等。蛋白質和酶通常由硫酸銨糊、蔗糖、甘油等穩定。例如，酶還可以添加底物和輔酶，以提高其穩定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有壹定的保護作用。核酸大分子通常儲存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標準緩沖液中。
3、存放溫度低，大部分存放在冰箱裏0度左右，也有低壹些的，視不同物質而定。