第二階段:遺傳毒性試驗、30天餵養試驗和傳統致畸試驗。
遺傳毒性試驗的組合應考慮原核細胞與真核細胞、體內試驗與體外試驗相結合的原則。從Ames試驗或V79/HGPRT基因突變試驗、骨髓細胞微核試驗或哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗、TK基因突變試驗或小鼠精子異常分析(或睪丸染色體畸變分析試驗)中選擇壹種。
①基因突變試驗:首選鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗(Ames試驗)，其次是V79/HGPRT基因突變試驗，必要時可選擇其他試驗。
②骨髓細胞微核試驗或哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗。
③TK基因突變試驗。
④小鼠精子異常或睪丸染色體畸變分析。
⑤其他替代性遺傳毒性試驗:顯性致死試驗、果蠅伴性隱性致死試驗、非程序性DNA合成試驗。
⑥30天餵養試驗。
⑦傳統致畸試驗。
第三階段:亞慢性毒性實驗:實驗期為3個月左右，測試本品毒性對機體重要器官或生理功能的影響，包括生殖和致畸實驗。
第四階段:慢性毒性試驗:考察少量本品對機體的長期影響，確定最大非使用劑量(MNL)。壹般以壽命較短的敏感動物的壹生作為壹個試驗階段，如大鼠2年，小鼠1.5年。
ADI和LD50是國際上常用的主要毒性和安全性指標，其中，每日可接受攝入量(ADI)是每天每公斤體重的毫克數，由聯合國糧農組織/世衛組織下屬的食品添加劑專家聯合委員會(JECFA)每年根據各國使用的食品添加劑的毒性報告提出，每年由CCFA討論，各國對某種食品添加劑的ADI進行評估、修改或撤銷。眾所周知，ADI值是通過小動物(大鼠、小鼠等)長期毒性試驗得出的最大非使用劑量(MNL)。)幾乎壹輩子，其1/100-1/500作為ADI值。根據ADI值，各國都規定了食品中的最大允許用量，從食品安全的角度來說應該是有保證的。
1)幾種常見食品添加劑的ADI值見表1。
表1
名稱ADImg/kg最大劑量g/kg用法
六偏磷酸鈉0-70 5.0方便面
三聚磷酸鈉0-70 5.0方便面
磷酸二氫鈣0-70 4.0面包、饅頭、餅幹
磷酸氫鈣0-70 1.0發酵產品，嬰兒食品
過氧化苯甲酰0-40 0.06面粉陳化增白。
硬脂酸鈣乳酸鈣(CSL) 0-20 2.0面包和糕點
硬脂酸乳酸鈉(SSL) 0-20 2.0面包和糕點
0-5 0.2-1苯甲酸食品保鮮
山梨酸0-25 0.2-2食品防腐
乳酸亞鐵豆奶粉0-0.8份0.2-0.5份
丁基羥基茴香醚(BHA)0-0.5 0.1-0.2食用油、油炸食品、餅幹、方便面、方便米飯。
二丁基羥基甲苯0-0.3 0.2早餐麥片
註:食品中食品添加劑的最大量壹般是根據JECFA推薦的丹麥預算法(DBM)計算的。這種方法已被世界各國認可並采用，即食品添加劑最大量=40×ADI。
2) LD50(致死劑量)
LD50是判斷食品添加劑安全性的第二個常用指標，也是任何食品添加劑毒理學評價中的第壹階段急性毒性試驗指標，壹般表示食品添加劑的急性毒性。在我國《食品安全毒理學評價的程序和方法》(GB 15193.3-2003)發布的急性毒性(LD50)劑量分級標準表中，食品中使用的化學品按照LD50分為六類，見表2。
表2
毒性大鼠口服LD50mg/kg相當於人致死劑量mg/kg和人致死劑量g/人。
劇毒
戲劇性病毒1—50 500—4000 0.5
中毒性51—500 4000—30000 5
低毒501—5000 30000—250000 50
實際無毒5001—15000 250000—5000000 500。
無毒> 15000 >500000 2500
壹般來說，對動物毒性低的物質對人體的毒性也低。LD50越大，毒性越小，食品使用時安全性越高。表3顯示了幾種常見食品添加劑的LD50。
表3
產品名稱LD50 mg/kg GB2760規定的最大劑量為g/kg。主要用途
過氧化苯甲酰7710 0.06面粉處理劑
苯甲酸2530 0.2-0.8食品防腐劑
丁基羥基茴香醚(BHA) 2000-5000 0.2抗氧劑
二丁基羥基甲苯(BHT) 890 0.2抗氧化劑
亞硝酸鈉220 0.15殘留0.05肉類著色劑。
亞硝酸鉀200 0.15殘留0.05肉類著色劑
從表3可以看出，過氧化苯甲酰屬於無毒範疇，苯甲酸屬於低毒範疇，而肉制品中常用的亞硝酸鈉和亞硝酸鉀以及早餐谷物中添加的營養強化劑氧化鋅都屬於有毒範疇。