抗體的基本概念：多克隆抗體（多個淋巴細胞克隆所分泌的抗體）和單克隆抗體（單個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體）
單克隆抗體的特點：
高度均質（同壹亞類），化學組成均壹，不含或很少含Ig
特異性強，只針對某壹種抗原表位
親和力強
抗原用量少，無須純化
無批間差異
來源穩定，可達批生產，容易標準化
不易形成沈澱線
操作比較麻煩
什麽條件下需要制備單抗：
目的蛋白有類似的結構
抗原不純，無法分開
多抗的效果不好（已經排除非特異性反應）
希望將抗體用於治療，研制成藥物
希望將抗體用於診斷，研制成診斷試劑。
第壹節? 多克隆抗體的之別
壹、多克隆抗體制備的原理
抗體制備、動物免疫、抗體純化
二、多抗的基本條件
1. 免疫原的制備
顆粒性抗原：細胞、病毒、細菌等，壹般具有較強的免疫原性，可以不加佐劑，直接進行腹腔註射。
可溶性抗原：可溶性抗原的來源主要是天然純化，或者用目的基因在原核細胞或者真核細胞中表達，可溶性抗原需要與弗氏佐劑完全或不完全混勻，才可以進行免疫。
（1） 完全抗原的提取：細胞破碎法、抗原提取、抗原的純化
（2）半抗原與載體的交聯：載體的選擇、半抗原與載體偶聯的方法、偶聯復合物的鑒定
（3）合成肽抗原：免疫原性肽的選擇、肽的合成和純化
2. 免疫動物的選擇：
3. 佐劑的準備：
佐劑的種類：無機佐劑、有機佐劑、合成佐劑、油劑
三、多克隆抗體制備的基本方法
1.? 抗原計量、免疫途徑與免疫日程
免疫動物的方法：
免疫原值被：
無佐劑免疫法：適用於顆粒性抗原
弗氏佐劑免疫法：適用於可溶性抗原
鋁佐劑免疫法：適用於人的免疫
免疫動物（壹般選擇雌性動物，溫順並且可以生產）
皮內免疫法
皮下或肌肉免疫法
淋巴結免疫法
混合法
抗體效價滿意後靜脈註射加強免疫
常見的註射方法；皮下註射、皮內註射、尾靜脈註射、靜脈註射
2. 小樣試血與采血
抗血清的獲得：眼眶取血、頸動脈放血、心臟采血
免疫效果評價：取血（兔耳動脈、鼠尾靜脈）、檢測（雙向免疫擴散、ELISA）
3. 抗體的分離和純化技術
鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析、親和層析法、電泳分離法
親和層析法原理：利用蛋白質之間的特異性結合（抗原-抗體、受體-配體）將壹種配基與凝膠顆粒結合，捕捉與他相配的物質，洗脫另外壹種物質，並且洗脫壹般用改變pH的方法。
主要步驟：將蛋白質與活化柱子結合，將腹水或者血清處理後過柱子，用結合緩沖液洗柱子（知道A280為零），永安氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液，測定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升高的樣品。
4. 抗體的鑒定
蛋白質濃度的測定：紫外分光比色法、雙縮脲法、福林酚法、
免疫效果評價：雙向免疫擴散、ELISA
純度分析：免疫印跡（WB）
抗體類別分析：免疫金試條
親和力分析：ELISA、熒光偏振
5.? 抗體的保存
抗體的濃縮：吸收、蒸發、超濾
抗體的保存：濃縮抗議+甘油+防腐劑
免疫效果不佳的原因可能是：抗原純度不夠、免疫原性低、免疫途徑乳化不合格、免疫劑量不合適、動物疾病或者種屬差異小。
第二節? 單克隆抗體制備技術
壹、單克隆抗體制備的原理
1個B細胞只能產生1個抗體。方法是細胞工程雜交技術和B細胞雜交瘤技術
需要將單克隆B細胞和腫瘤細胞相結合才可以永久產生單抗
Barski等發現細胞額自然融合現象，但是頻率很低
岡田等發現滅火的仙臺稟賦和聚乙二醇能顯著提高細胞融合的效率。
二、單抗制備的基本條件
需要培養正常的B細胞以及B細胞融合的腫瘤細胞
1. 動物的免疫抗原與載體、動物的選擇、免疫途徑
舉例：小鼠免疫
第壹次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐劑——小鼠背部皮下註射（4周後）
第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐劑——小鼠背部皮下註射（3周後）
第三次免疫：可溶性抗原加生理鹽水——小鼠腹腔註射（10天後檢測血清效價）
加強免疫：可溶性抗原加生理鹽水——小鼠腹腔註射（3天後）
細胞融合
2.? 酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養
細胞DNA合成途徑：
次黃嘌呤（H）通過嘌呤合成跑路途經合成HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）進壹步合成鳥嘌呤核苷酸
胸腺嘧啶核苷（T）通過嘧啶合成旁路途經合成TK（胸腺嘧啶核苷激酶），進壹步合成胸腺嘧啶脫氧核苷酸
氨基酸、谷氨酰胺、鳥核苷單磷酸通過核酸生物合成主要途徑結合上面兩步合成的鳥嘌呤核苷酸以及胸腺嘧啶脫氧核苷酸形成DNA
將第三步當中氨基端變為氨基碟呤（A），則無法形成DNA。
因此酶缺陷型細胞的篩選就是HAT篩選
3. 單抗檢測方法的建立
免疫酶技術
免疫熒光技術
免疫擴散技術
三、單抗制備的基本方法
1. 酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養
組織培養的基本條件：
儀器：包括CO2培養箱、倒置顯微鏡、超凈臺、液氮罐、低速低溫離心機
試劑：培養液、HAT選擇培養液、HT培養液、血清、抗生素
耗材：培養板、培養品、吸管、移液管
骨髓瘤細胞系的選擇要點：
（1）? 所選的骨髓瘤細胞應與提供免疫脾細胞的動物品系相同
（2）? 自身不產生免疫球蛋白的重鏈和輕鏈
（3）? 對氨基碟呤敏感
（4）? 與免疫脾細胞融合後產生穩定分泌的Ig雜交細胞
2. 飼養細胞的制備
飼養細胞的作用：
（1） 增加細胞濃度，滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的要求
（2）? 吞噬清楚死亡的細胞
（3）? 分泌生長刺激因子促進雜交瘤細胞的生長
飼養細胞的種類和制備方法
（1）? 小鼠腹腔巨噬細胞
（2）? 小鼠脾細胞
（3）? 成纖維細胞
3. ?脾細胞的分離
（1）? 拉頸椎處死小鼠
（2）? 無菌操作取出脾臟
（3）? 清洗、研磨
（4）? 收集細胞
（5）? 離心洗滌
（6）? 細胞計數
4. ?細胞融合：骨髓瘤細胞和脾細胞按照1:10或1:5的比例混合並加入促融劑PEG
細胞融合的方法：PEG融合、仙臺病毒、電融合
5. HAT選擇性培養
? HAT選擇性培養的原理：細胞的DNA生物合成右主要途徑和補償途徑。當A存在是，能夠阻斷DNA合成的主要途徑，須通過補償途徑合成DNA，這時就需要HGPRT利用H合成DNA，或者TK利用T合成DNA。
? 由於選用西黃嘌呤鳥嘌呤荷塘轉移酶缺陷型（HPRR-）骨髓瘤在細胞或者胸腺嘧啶割肝激酶缺陷型（TK-）細胞作為親本，該校只能通過群全條件的DNA培養基才可合成，因此雜種細胞通過互補作用獲得HGPPT或者TK基因。只有雜種細胞可以活，酶缺乏性細胞完全無法存活，單克隆B細胞壹般不能長期生長，就起到了分離雜交細胞的作用。
? 細胞生長情況：融合3-4天之後，可以看到刑訴骨髓瘤細胞，混元透亮的克隆。融合後第7-9天去培養上清，檢測特異性抗體。
? 篩選後存活的細胞就是脾細胞和骨髓瘤細胞融合細胞。
6. ?陽性克隆的篩選
分泌單克隆抗體雜交瘤細胞的檢測方法
免疫酶技術：簡介ELISA法
免疫熒光技術：間接免疫熒光測定法、流式細胞分析技術（陰性對照：骨髓瘤細胞培養上清，陽性對照：免疫鼠血清）
7. ?克隆化培養：陽性細胞的單克隆化
克隆是指由單個細胞繁殖、擴增而形成的性狀均壹的細胞集落的過程。
常見方法有：有限稀釋法和軟瓊脂克隆技術
有限稀釋法：從陽性分泌孔收集雜交瘤細胞。
軟瓊脂克隆技術：從陽性分泌孔中收集雜交瘤細胞，壹適當濃度雜交瘤細胞加入到軟瓊脂培養基中，形成有壹個細胞增殖來的細胞集群。
單克隆抗體的鑒定：
（1）? 抗體敏感性檢測：對腹水和培養基上清進行效價測定
（2）? 抗體特異性鑒定：是否與其他抗原右交互反應。
（3） 抗體效價測定
（4）? 抗體亞類鑒定：IgG（IgG1、IgG2、IgG3）、IgM
（5）? 抗體親和力鑒定
（6）? 識別表位分析
8. 單克隆抗體的擴大生產：細胞培養法、小鼠體內誘生法、生物反應器
細胞培養法：雜交瘤細胞、培養瓶或罐中培養、收集上清液、純化抗體
動物體內誘生法：Balb/c小鼠、腹腔註射0.5ml液體是啦或降植烷、腹腔內接種雜交瘤細胞、收集腹水
生物反應器：發酵罐培養
單抗培養常見的問題：
（1）? 汙染：培養環境、操作
（2）? 融合細胞不生長：PEG、血清、HAT培養基
（3）? 抗體分泌不足：支原體汙染、細胞突變、培養體系有問題
（4）? 雜交瘤細胞難以克隆化：血清質量、細胞活性
第三節? 基因工程抗體制備技術
基因工程抗體：通過基因工程的手段，按照個人意願進行細胞人工改造的技術。
優點主要有：特異性高、質量穩定、成本低廉、工藝簡單、異源性滴低、穿透性好、功能豐富。
壹、鼠源抗體人源化
鼠源抗體應用中的障礙：免疫原性、半衰期短、抗體功能片段失活。
1. ?嵌合抗體：可變區基因克隆、表達載體的構建、嵌合抗體的表達
2. ?改型抗體
二、小分子抗體：Fab抗體、Fv抗體和單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位
小分子抗體的優點：
（1）可在原核體系中表達，降低生產成本。
（2）因為其分子量小，穿透能力強，易進入病竈部位，有利於對腫瘤等疾病的治療。
（3）不含Fc片段，不與Fc受體結合，可減少因廣泛分布的Fc受體而帶來的不利影響。
（4）在體內半衰期短，有利於體內毒性物質的消除
（5）易於進壹步基因工程分改造。
三、]基於抗體的應用
1. ?CAR-T免疫治療：
? CAR-T免疫療法：即嵌合抗原受體T細胞免疫療法，是壹種新型的過繼性細胞療法，即利用病人自身的免疫細胞來清除癌細胞的細胞療法，並非藥物。
? CAR-T技術：通過整個嵌合抗原受體的經過基因修飾的T細胞抵抗腫瘤細胞的療法。嵌合抗原受體可以特異性識別腫瘤相關抗原或者腫瘤特異性抗原，識別結合後將激活及增值信號傳遞到T細胞內，引起T細胞激活，增殖釋放細胞因子，從而殺傷腫瘤細胞。
2. 免疫檢查點
3.? 免疫毒素
4.? ADC
5.? 雙特異性抗體
第四節?[endif]抗體庫技術
抗體庫技術：即用基因克隆技術將全套抗體輕重鏈可變區基因克隆出來，重組到原核表達載體上，通過原核系統直接表達有功能的抗體分子片段，並篩選出特異性的抗體分子和可變區基因。
壹、噬菌體展示技術原理：噬菌體展示技術是將外源蛋白質或者DNA序列查到噬菌體外殼上的適當位置，使外源基因隨著外殼蛋白的表達而表達，同時，外源蛋白隨著噬菌體的重新組裝而展現倒是菌體表面的生物技術。到目前為止，人們已經靠發出單鏈絲狀噬菌體展示系統、T4噬菌體展示系統、λ噬菌體展示系統等。
二、噬菌體抗體制備的基本程序
1. ?收集淋巴細胞提取mRNA並轉錄到cDNA或直接提取斯堡基因組的DNA
2. ?擴增DNA的抗體可變區基因
3. [構建重組噬菌體庫
4. ?篩選所需特征的重組噬菌體
5. ?采用突變或鏈置換使親和力成熟
三、噬菌體抗體技術的特點
1. ?篩選步驟簡單、快速、有效
2. ?擴大了篩選流量，壹次就可以篩選多於1010個的克隆
3. ?抗體基因型與表現性聯系密切，基因穩定且容易改造
4. 模擬天然免疫系統親和力成熟過程
5. ?無需人工接種
6. ?可替代動物多克隆抗體
7. ?構建康體苦時。輕重鏈可變區基因在體外隨機組合，可產生體內部存在的輕重鏈組合，得到新的特異性抗體。
8. ?可以在預案和系統中表達，大規模生產方便，且成本低。
四、抗體庫技術的應用
1. ?制備全人源抗體
2. ?改良基因工程抗體