為了提取細胞核,應破碎細胞以分離細胞核,這應在甘油或其他保護劑中進行。
SDS十二烷基磺酸鈉:能破壞細胞膜和核膜,使組織蛋白與DNA分離。
CATB是破壞細胞膜的提取物~具體忘了~
DNA不溶於異丙醇,異丙醇能沈澱DNA,產生白色絮狀沈澱。用槍挑出來就行了。
下面是壹些具體的方法,希望有用。
基因組DNA提取方法
基因組DNA的制備是研究基因結構和功能的重要步驟,獲得的片段長度通常不小於100-200kb。在DNA提取過程中,要盡量避免各種使DNA斷裂、降解的因素,以保證DNA的完整性,為後續實驗奠定基礎。主要是CTAB法,其他方法有1物理方法:玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法。2化學法:異硫氰酸胍法、堿裂解法3生物法:酶法。根據核酸分離純化方法的不同,有:矽質材料、陰離子交換樹脂等。
測試步驟:
1.用胰蛋白酶消化貼壁細胞,並通過離心收集。
2.將細胞重懸於冷PBS中,沖洗壹次,並通過離心收集。再次進行測試步驟2。
3.加入5ml DNA提取緩沖液(10mmol/ltris-Cl,0.1mol/ledta,0.5% SDS)混勻。
4.加入25ul蛋白酶K,使終濃度達到100μ g/ml,混勻,50℃水浴3h。
5.用等體積的苯酚提取壹次,通過以2500rpm離心收集水相,用等體積的苯酚、氯仿和異戊醇的混合物提取壹次,通過以2500r/min離心收集水相。
6.用等體積的氯仿和異戊醇提取壹次。加入同體積的5mol/L LiCL,混勻,冰浴65438±00min。
7.以2500轉/分的速度離心10分鐘。將上清液轉移到離心管中。加入等體積的異丙醇。室溫10分鐘。
2500轉/分,離心65438±00分鐘。丟棄上清液。
8.加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉(PH5.2)和2倍體積預冷的-20℃無水乙醇。-20℃20分鐘.
9、12000r/5min,室溫離心5分鐘。丟棄上清液。將DNA溶解在適量的TE中。
外周血DNA提取技術
分離外周血白細胞提取方法:
測試步驟:
1,取5ml人肘靜脈血,用EDTA抗凝,2500rpm離心10min。
2、仔細吸取上層血漿,分裝到三個0.5ml離心管中。
3.向血細胞中加入3倍體積的溶血血,搖勻,冰浴15min。
4.以2500rpm離心65438±00分鐘,棄去上清液。
5、加入10ml溶解血,搖勻,冰浴15min。
6.以3000rpm離心65438±00分鐘,棄去上清液。
7.倒置離心管以去除殘留液體。
8、取白細胞,-80?c冷凍。
測試要求:
血液與白細胞分離的間隔時間應在室溫下保持不超過2h,在4℃下保持不超過5h,以防白細胞自溶。
氯仿法提取外周血白細胞基因組DNA:
測試試劑:
Ligsisbuffer:
133 mnh 4h cl nhcl 7.12g 0.9 mnh 4h co 3 NH 4h co 30.071g 0.1 medta 0.5 medta 0.2ml;最後加入滅菌去離子水至1000ml,高壓滅菌。
ACD抗凝劑:檸檬酸1.68g檸檬酸鈉4.62g葡萄糖5.15g;;最後,加入滅菌去離子水至350ml,高壓滅菌。
提取緩沖液:
10 mmtriscl(PH = 8.0)1 mtris。cl(PH = 8.0)1ml 0.1 mmedta(PH = 8.0)0.5 mmedta(PH = 8.0)20ml 0.5% SDS 10% SDS 0.5ml;最後,加入滅菌去離子水至100ml,高壓滅菌。
測試步驟:
1.向500μl抗凝劑中加入ligsisbuffer1000μl,充分混合至澄清。以4000rpm的速度離心5分鐘。丟棄上清液。
2.向沈澱中加入ligsisbuffer1500μl,並充分勻漿。以6000rpm的速度離心5分鐘。
3.完全棄去上清液,加入500μ l提取緩沖液(細胞裂解),混勻,置於37℃,溶於水中65438±0h。
4.加入8μl蛋白酶K,混合並在37℃過夜(或55℃過夜3h,但37℃更好)。
5.向每管中加入450μl飽和苯酚(取溶液下層),緩慢搖動65438±00分鐘,以5500rpm離心65438±05分鐘。
6.取上清液,每管加入250μl飽和苯酚和250μl氯仿-異戊醇,搖勻65438±00分鐘,以5500rpm離心65438±05分鐘。
7.取上清液,每管加入500μl氯仿-異戊醇,搖勻65438±00分鐘,以5500rpm離心65438±05分鐘。
8.取上清液,每管加入50μl 3M naac++,用適量無水乙醇預冷至滿,搖勻,於-20℃保存2h以上。
9.以12000轉/分的速度離心20min。除去上清液,加入500μl 70%乙醇,以12000rpm離心5min,除去上清液,在50-60℃幹燥。
10,加入50μl滅菌去離子水,旋轉混勻。
NaI法提取外周血白細胞基因組:
實驗步驟:
1.取100ul外周抗凝劑(全血)於eppendorf管中,以12000rpm離心12分鐘。
2.棄去上清液,加入200ul雙蒸水溶解,搖勻20s。
3.混合後,加入200微升6MNaI溶液,搖勻20秒。
4.加入氯仿/異戊醇(24: 1) 400 ul,邊加邊搖勻,搖勻20s,以12000rpm離心12min。
5.取350ul上清液,加入另壹個新的eppendorf管中,加入0.6倍的異丙醇,搖勻20s,室溫放置65438±05分鐘,將反應體系在65438±05000 rpm下靜置65438±02分鐘後離心,使沈澱附著在eppendorf管壁上。
6.棄去異丙醇,加入70%乙醇1毫升(無振蕩),以15000轉/分鐘離心12分鐘。
7.棄去乙醇,打開eppendorf管蓋,晾幹(37℃培養箱),加入30ul 1x te溶液,溶解DNA 12h以上,配制好的DNA溶液保存在-20℃冰箱中備用。
從外周血白細胞中提取基因的常用方法:
測試原則:
酚/氯仿用於提取DNA,通過反復提取酚作為蛋白質的變性劑,使蛋白質變性。SDS(十二烷基磺酸鈉)裂解細胞膜,在蛋白酶K和EDTA存在下消化蛋白質或多肽或小肽分子,核蛋白變性降解,使DNA從核蛋白中解離出來。DNA溶於水,不溶於有機溶劑。蛋白質分子表面有親水基團,容易水合,在表面形成水合層,使蛋白質分子順利進入水溶液,形成穩定的膠體溶液。當有機溶液存在時,蛋白質的膠體穩定性被破壞,變性沈澱。離心後,有機溶劑在試管底部(有機相),DNA存在於上層水相中,蛋白質沈澱在兩相之間。酚-氯仿萃取的作用是去除未消化的蛋白質。氯仿的作用是幫助分離水相和有機相,並從DNA溶液中除去苯酚。提取的DNA溶液在1/103mol/LNaCl的存在下用兩倍體積的無水乙醇沈澱,回收的DNA用70%乙醇洗滌以從DNA沈澱物中除去鹽,然後真空幹燥,然後用te緩沖液溶解備用。
測試步驟:
1.室溫下解凍1mlEDTA抗凝凍血,轉移至5ml離心管中,加入1ml磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS),混勻,3500rpm離心15min,傾出含溶解紅細胞的上清液。再說壹遍。白細胞沈澱用0.7mlDNA提取液懸浮,37℃水浴孵育65438±0h。
2.將白細胞懸浮於上述DNA提取液中,37℃水浴孵育65438±0h,然後加入65438±0mg/ml的蛋白酶K0.2ml,直至終濃度為100-200μg/ml,上下旋轉使其混合均勻,使液體變粘稠。50℃水浴3h,細胞裂解和蛋白質消化。在保溫過程中,應不時上下旋轉幾次,使反應液混合均勻。
3.待反應液冷卻至室溫後,加入等體積的飽和苯酚溶液,輕輕上下旋轉離心管5-65438±00分鐘,直至水相和苯酚相混合均勻形成乳液。以5000rpm離心65438±05分鐘,用大口移液管小心吸取上層粘稠水相,並移至另壹個離心管中。重復苯酚提取壹次。加入等體積的氯仿:異戊醇(24: 1),上下旋轉混勻,以5000rpm離心15min,用大口吸管小心吸取上層粘稠水相,轉移至另壹離心管中。再說壹遍。
4.加入1/5體積的3 mol/l NAAAC和2體積預冷的無水乙醇,室溫下緩慢搖動離心管,即出現乳白色絮狀DNA。用玻璃棒小心挑出渾濁的DNA,轉移到另壹個1.5ml離心管中,加入0.2ml 70%乙醇,5000rpm離心5分鐘。洗滌DNA,棄去上清液,去除殘留鹽。再說壹遍。室溫下揮發殘留的乙醇,但不要讓DNA完全幹燥。加入20ul TE溶液溶解DNA,放在搖床上慢慢搖動。DNA完全溶解壹般需要12-24h。將制備好的DNA溶液保存在-20℃冰箱中備用。
真核DNA的制備
壹般真核細胞的基因組DNA為107-9bp,可從新鮮組織、培養細胞或低溫保存的組織細胞中提取。通常通過在EDTA和SDS存在下用蛋白酶K消化細胞,然後用苯酚提取來實現。該方法獲得的DNA不僅可用於酶切後的Southern分析,還可用於PCR模板、文庫構建等實驗。
根據材料來源的不同,采用不同的材料處理方法,後續的DNA提取方法大體相似,但要考慮以下兩個原則:
1.防止和抑制DNA酶對DNA的降解。
2.最小化對溶液中DNA的機械剪切損傷。
試劑制備:
1、TE:10 mmtris-HCl(ph 7.8);1mMEDTA(pH8.0).
2、TBS:25mm tris-HCl(ph 7.4);200mMNaCl5mMKCl .
3.裂解緩沖液:250mMSDS使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4、20%十二烷基硫酸鈉
5,2毫克/毫升蛋白酶k。
6.Tris飽和酚(pH8.0),酚/氯仿(酚:氯仿= 1: 1)和氯仿。
7.無水乙醇和75%乙醇
測試步驟:
材料處理:
1,新鮮或冷凍組織加工:
1)取0.3-0.5cm3組織塊,切開,加入TE 0.5ml TE,轉入勻漿器勻漿。
2)將勻漿轉移到1.5毫升離心管中。
3)加入25毫升20% SDS和25毫升蛋白酶K(2毫克/毫升),混勻。
4)60°C水浴1-3小時。
2.培養細胞的處理:
1)懸浮培養的細胞後,用TBS洗滌壹次。
2)離心4000g×5min,去除上清液。
3)加入10倍體積的裂解緩沖液。
4)在50-55°C的溫度下水浴1-2小時。
DNA提取:
1.向上述樣品處理溶液中加入等體積的飽和苯酚,輕輕充分混合3min。
2.離心5000g×10min,取上層水相至另壹個1.5ml離心管中。
3.加入等體積的飽和苯酚,混勻,離心5000g×10min,取上層水相至另壹管中。
4.加入等體積的苯酚/氯仿,輕輕混合,離心5000g×10min,取上層水相至另壹管中。如果水相仍然不透明,該步驟可以重復幾次。
5.加入等體積的氯仿,輕輕混合,離心5000g×10min,取上層水相至另壹管。
6.加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的無水乙醇,輕輕倒置混勻。
7.出現絮凝物後,離心5000g×5min,棄去上清液。
8.用75%乙醇洗滌沈澱,離心5000g×3min,棄去上清液。
9.室溫下揮發乙醇,沈澱近透明後,加入50-100mlTE溶解過夜。
從植物組織中提取DNA
測試原則:
脫氧核糖核酸(DNA)是所有生物細胞的重要組成部分,主要存在於細胞核中。鹽溶解是提取DNA的常規技術之壹。從細胞中分離出來的DNA是蛋白結合DNA,其中還含有大量的RNA,即核糖核蛋白。如何有效分離這兩種核蛋白是技術的關鍵。DNA不溶於0.1.4 mol/L NaCl溶液,而RNA可溶於0.1.4 mol/L NaCl溶液。利用這壹特性,可以將它們從破碎細胞的細胞質中分離出來。在制備過程中,當細胞破碎時,DNA酶被釋放到提取液中,因此DNA的產量受到降解的影響。在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA,既能抑制酶的活性,又能使蛋白質變性,從核酸中分離出來。然後,加入0.15% SDS作為陰離子去汙劑,攪拌2小時,或用氯仿-異丙醇除去蛋白質,離心沈澱蛋白質,得到核酸。然後,可以使用95%預冷的乙醇從除去蛋白質的提取液中沈澱DNA。
植物DNA的SDS提取;
測試試劑:
1.研磨緩沖液:將59.63gNaCl、13.25g檸檬酸三鈉、37.2 g EDTA-Na分別溶解並合二為壹,用0.2mol/L NaOH調至pH7.0,定容為1000ml。
2.10×SSC溶液:稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉,分別溶解,定容至1000ml。
3.1×SSC溶液:用10×SSC溶液稀釋10倍。
4.0.1×SSC溶液:用1×SSC溶液稀釋10倍。
5.核糖核酸酶溶液:用0.1.4 mol/l NaCl溶液配成25mg/ml酶液,用1mol/LHCl,pH為5.0,使用前80℃水浴5min處理5min(破壞可能的脫氧核糖核酸酶)。
6.氯仿-異戊醇:將24毫升氯仿與1毫升異戊醇混合。
7.5mol/L高氯酸鈉溶液:稱取NaClO4。H2O 70.23 g,先加入少量蒸餾水溶解後制成100ml。
8.SDS(十二烷基硫酸鈉)化學試劑重結晶:將SDS放入無水乙醇中至飽和,然後溶於70 ~ 80℃的水浴中,趁熱過濾,冷卻,然後將濾液放入冰箱中,室溫下晾幹備用。
9、1摩爾/升.
10、0.2摩爾/升氫氧化鈉.
11、二苯胺乙醛試劑:1.5g二苯胺溶於100ml冰醋酸中,加入1.5ml濃硫酸,置於棕色瓶中,避光保存,加入0.1ml乙醛溶液[濃縮乙醛:H2O = 65438+]
12,1.0mol/L高酸溶液(HClO4)。
13、0.05摩爾/升氫氧化鈉.
14、DNA標準溶液:取DNA25mg標準DNA溶於少量0.05mol.L-1NaOH中,然後用0.05mol/ln NaOH使體積達到25ml,再用轉移管將此溶液吸取至5ml-50ml容量瓶中,加入5.0ml 1.5mol/LHC lo 4,混勻冷卻,再用0.5mol。
實驗步驟:
1.稱取10g嫩植物組織,切成塊,放入研缽中,加入10ml預冷研磨緩沖液,加入約0.1g SDS,放入冰浴中研磨成糊狀。
2.將勻漿轉移至25ml刻度試管中,加入等體積的氯仿-異戊醇混合溶液,加塞子,劇烈搖動30s,轉移至離心管中,靜置壹段時間,除去組織蛋白。以4000轉/分鐘的速度離心5min。
3.離心形成三層,小心將上層清液吸至有刻度的試管中,棄去中間層的細胞碎片,下層的變性蛋白和氯仿。
4.將試管在72℃水浴中保持3min(不超過4min),使組織中的DNA酶失活,然後迅速取出,在冰水浴中冷卻至室溫,加入5mol/L的高氯酸鈉溶液[提取液:高氯酸鈉溶液= 4: 1 (v/v)]使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1 mol/v。
5.再次向大試管中加入等體積的氯仿-異戊醇混合物,搖勻65438±0min,靜置,室溫(4000 rpm)離心5 min,取上清液置於小燒杯中。
6.用滴管吸取95%預冷的乙醇,緩慢加入燒杯中上清液表面,直至乙醇體積為上清液體積的兩倍,用玻璃棒輕輕攪拌。此時,核酸以纖維狀沈澱的形式迅速纏繞在玻璃棒上。
7.然後加入約0.5毫升10×SSC,使最終濃度為1×SSC。
8.重復步驟6和步驟7,獲得DNA的粗產物。
9.加入處理後的RNA酶溶液,使其終濃度為50 ~ 70μ g/ml,並在37℃水浴中保持30分鐘以去除RNA。
10.加入等體積的氯仿-異戊醇混合溶液,在三角瓶中搖勻65438±0min,然後除去殘留蛋白和加入的Rnase蛋白,室溫下4000rpm離心5min,收集上層水溶液。
11,然後在步驟6和7中處理以獲得純化的DNA溶液。
CTAB法提取植物DNA
測試步驟:
1.稱取2-3g鮮葉,切成片,放入研缽中,在液氮中研磨成粉。
2.將粉末轉移到裝有7ml預熱的15×CTAB提取緩沖液的離心管中,快速混合,置於65℃水浴中30分鐘。
3.取出離心管,冷卻至室溫,加入氯仿/異戊醇(24:1),混勻,室溫下2300 rpm離心20min。
4.將上清液轉移到另壹個新的15ml離心管中,加入1/10體積的10% CTAB和等體積的氯仿/異戊醇。充分混合,並以2300轉/分的速度離心20分鐘。
5.將上清液轉移到另壹個新的15ml離心管中,加入等體積的1% CTAB沈澱緩沖液,輕輕搖動,直到形成絮狀DNA沈澱。以65438±0000 rpm離心65438±00分鐘,以在試管底部沈澱DNA。
6.加入1.5-2ml 1mol/LNaCl和5μlRNase,置於56℃水浴中過夜。
7.待DNA完全溶解後,加入2-3ml預冷至4℃的95%冰乙醇沈澱DNA,挑出DNA,置於15ml離心管中,用70%乙醇洗滌30分鐘。
8.離心5s,倒出70%乙醇,在95%乙醇中浸泡5min,倒出95%乙醇,在超凈工作臺上吹幹。
9.將風幹的DNA直接保存於4℃或溶解於100μlTE溶液中,保存於-20℃。
細菌DNA的提取方法
壹些不容易提取的細菌的方法:
測試試劑:
提取緩沖液:2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)(去色素)100mMTris-HCl(pH8.0)。
25毫克乙二胺四乙酸二鈉(pH8.0)
10毫升
2毫升
DEPC-水(抑制核糖核酸酶活性)
3MNaAc(pH5.2)
96%乙醇
70%乙醇
測試步驟:
1,萃取緩沖液在65℃預熱。
2.將細菌加入預熱的緩沖液(700微升)中,在65℃下充分混合65438±00分鐘。
3.加入苯酚/氯仿/異戊醇(25: 24: 1),以12000 rpm振蕩,離心10min。
4.取上清液,加入氯仿/異戊醇(24: 1),以65438±02000 rpm搖勻,離心65438±00min。
5.再次重復步驟4。
6.加入1/10體積的3M乙酸鈉和1.5體積的乙醇(或加入等體積的異丙醇),在- 20C下沈澱。
7.以2000轉/分的速度離心65438±00分鐘。
8.棄去上清液,用70%乙醇洗滌沈澱,或用100%乙醇洗滌,然後溶於100ml水中。
提取細菌DNA的常用方法:
實驗步驟:
1.將該菌株接種於液體LB培養基中,並在37℃振蕩培養過夜。
2.取1.5ml培養物,以12000rpm離心2分鐘。
3.向沈澱物中加入567微升TE緩沖液,反復吹氣使其重新懸浮,加入30微升10% SDS和15微升蛋白酶K,混勻,並在37℃下孵育1h。
4.加入100ul5mol/LNaCl,混勻,然後加入80ulCTAB/NaCl溶液,混勻後在65℃孵育10min。
5.加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇,混勻,離心4-5min,將上清液轉移至新管中,加入0.6-0.8倍體積的異丙醇,輕輕攪拌至DNA沈澱,沈澱可輕微離心。
6.用1毫升70%乙醇洗滌沈澱物後,離心並丟棄乙醇。
真菌DNA提取和總結的兩種方法:
第壹種方法:
測試步驟:
1.取0.5g真菌菌絲體,在液氮中快速研磨成粉末。
2.加入4mL提取液,快速搖勻。
3.加入等體積的4mL氯仿:異戊醇(24:1),渦旋3 ~ 5分鐘(此處為無酚粗提)。
4.在4℃,65分鐘438+0000轉/分鐘下離心5分鐘。
5.再次用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)提取上清液。4℃,10000轉/分鐘離心5min。
6.取上清液,加入2/3倍體積預冷至-20℃的異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沈澱,混勻,靜置約30分鐘。
7.用毛細玻璃棒挑出絮狀沈澱,用75%乙醇反復沖洗數次,再用無水乙醇沖洗65438±0次,吹幹,重懸於500微升中。
8.加入1u RNA sea(10mg/mL)並在37℃處理1h。
9.分別用苯酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)提取1次。4℃,10000轉/分鐘離心5min。
10,取上清液,加入1/10倍體積的3 mnaac和2.5倍體積的無水乙醇,在-70℃沈澱30min以上。
11.用75%乙醇沖洗沈澱,晾幹,溶於200微升,儲存於-20℃備用。
DNA提取液:0.2MTris-HCl(pH7.5),0.5MNaCl,0.01.05 EDTA,1% SDS,3MNaAc。
第二種方法:
測試步驟:
1,真菌菌絲體0.5-1g,在液氮中快速研磨成粉末。
2.加入3ml 65℃預熱的DNA提取緩沖液,在65℃水浴中快速搖勻30min,混勻2-3次。
3.加1mL5MKAc,冰浴20min。
4.等體積氯仿:異戊醇(24:65min438+0)提取1次(10000 rpm,4℃離心5分鐘)。
5.取上清液,在-20℃下加入2/3倍體積預冷的異丙醇,混勻,靜置約30分鐘。
6.用毛細玻璃棒挑出絮狀沈澱,用75%乙醇反復沖洗數次,再用無水乙醇沖洗65438±0次,吹幹,重懸於500微升中。
7.加入1u RNA sea(10mg/mL)並在37℃處理1h。
8.分別用苯酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)提取1次。4℃,10000轉/分鐘離心5min。
9,取上清液,1/10V3MNaAc,2.5V體積無水乙醇,在-70℃沈澱30min以上。
10.用75%乙醇沖洗沈澱,晾幹,溶於200微升,儲存於-20℃備用。
植物基因組提取(CATB法)
作者:時間:2008-05-13 14:26:27來源:生物谷瀏覽評論
壹、實驗目的
掌握植物總DNA的提取方法和基本原理。學會根據不同的植物和實驗要求,設計和改進植物總DNA的提取方法。
二、實驗原理
通常,植物組織和細胞通過機械研磨被壓碎。由於植物細胞的勻漿中含有許多對DNA提取有不利影響的酶(尤其是氧化酶),因此在提取緩沖液中應加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶的活性。在液氮中研磨,物料容易破碎,各種酶在研磨過程中的作用降低。
血漿表面活性劑,如十二烷基硫酸鈉(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化銨(簡稱CTAB)、十二烷基硫酸鈉(簡稱SDS),能溶解細胞膜和核膜蛋白,解聚核蛋白和遊離DNA。加入有機溶劑如苯酚和氯仿可以使蛋白質變性並使萃取相分離。因為核酸(DNA和RNA)極易溶於水,離心後可以從提取物中除去細胞碎片和大部分蛋白質。向上清液中加入無水乙醇沈澱DNA,將沈澱的DNA溶於te溶液中,得到植物總DNA溶液。
三、實驗材料
水稻的幼葉
四、主要公式
2% CTAB提取緩沖液:CTAB 4g NaCl 16.364g 1m Tris-HCl 20ml(pH 8.0)0.5m EDTA 8ml,先用70ml ddH2O溶解,然後滅菌至200ml,冷卻至0.2-1% 2-巰基乙醇(400ul)。
動詞 (verb的縮寫)實驗步驟
1.DNA提取
(1) 2%CTAB提取緩沖液在65℃水浴中預熱。
(2)將少量葉子(約1g)放入研缽中,用液氮研磨成粉末;
(3)加入700微升2%CTAB提取緩沖液並輕輕攪拌;
(4)將研磨液倒入1.5 ml滅菌,研磨液高度約占管的三分之二;
(5)放入65℃的水浴或恒溫箱中,每隔10 min輕輕搖動壹次,40 min後取出;
(6)冷卻2 min後,加入氯仿-異戊醇(24: 1)至管滿,劇烈搖動2~3 min,使其混合均勻;
(7)將其放入離心機中,以10 000 rpm的轉速離心10分鐘。同時混600?l異丙醇加入到另壹個新的滅菌劑中;
(8)以10000 rpm離心1 min後,用移液管輕輕吸取上清液,轉移到裝有異丙醇的容器中,緩慢上下搖動離心管30秒,使異丙醇和水層充分混合,直至能看到DNA絮狀物;
(9)以9)10000 rpm離心1 min後,立即倒出液體,註意不要倒出白色DNA沈澱,並將離心管倒置在鋪好的紙巾上;(10)60秒後,豎起離心管並加入720?75%的乙醇和80?L 5 M醋酸鈉,輕輕旋轉,用手指輕彈管尖,使管底的沈澱物和DNA塊浮在液體中;
(11)放置30分鐘,溶解DNA塊中的雜質;
(12)10000 rpm離心1 min,然後倒出液體,加入800?L 75%乙醇,再洗滌DNA 30分鐘;;
在(13)10000 rpm下離心30秒後,立即倒出液體並將離心管倒置在展開的紙巾上;幾分鐘後,離心管豎立,DNA幹燥(自然風幹或用風扇風幹);
(14)加50?L 0.5 × TE(含RNase)緩沖液,以溶解DNA,置於37℃恒溫箱中約15 h消化RNA
(15)儲存於-20℃以備後用。
2.DNA質量測試
瓊脂糖電泳檢測的原理和方法見實驗二。
不及物動詞有關註意事項
(1)刀片越細越好。
(2)移液管的使用。
(3)由於植物細胞中存在大量的脫氧核糖核酸酶,除了在提取液中加入EDTA抑制脫氧核糖核酸酶的活性外,第壹步要快,以免組織解凍,導致細胞溶解,釋放脫氧核糖核酸酶,降解DNA。