1.1體積測量法:又稱菌絲體濃度測量法。
通過測量壹定體積培養基中所含菌絲的數量,可以反映微生物的生長狀況。方法是取壹定量的待測培養液(如10 ml)置於帶刻度的離心管中,設定壹定的離心時間(如5分鐘)和轉速(如5000rpm),離心後倒出上清液,測得上清液體積為V,菌絲體濃度為(10-V)/65438。菌絲體濃度的測定是大規模工業發酵生產中微生物生長的重要監控指標。這種方法廣泛、簡單、快速,但需要設定壹致的處理條件,否則偏差會很大,因為離心沈澱中混有壹些固體營養物,結果會有些偏差。
1.2幹重法:
它可以通過離心或過濾來確定。壹般幹重是10-濕重的20%。離心法是將壹定體積待測培養液倒入離心管中,設定壹定的離心時間和轉速,離心,用清水離心洗滌1-5次,幹燥。幹燥可在105℃或100℃的烘箱中進行,或通過紅外線,或通過80℃或40℃的真空幹燥,然後稱重。如果用過濾法,絲狀真菌可以用濾紙過濾,細菌可以用醋酸纖維素膜等濾膜過濾。過濾後,用少量水洗滌,並在40℃真空幹燥。叫幹繁殖法很復雜。通常,當獲得的微生物產物為菌體時,常采用這種方法,如活性幹酵母(ADY),壹些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。
1.3比濁法:
微生物的生長導致培養物濁度增加。用紫外分光光度計測量某壹波長的光吸收值來判斷微生物的生長情況。壹個帶有側臂的特殊三角瓶可以用來定期跟蹤培養物中細菌的生長。將側臂插入光電比色計比色座的孔中,無需取菌液即可隨時測定其生長情況。這種方法主要用於監控發酵工業中細菌的生長。比如我用的是UNICO公司的紫外可見分光光度計,用比色管在600nm波長下定時測量發酵液的吸光度值OD600,來監測大腸桿菌的生長和誘導時間。
1.4菌絲長度測量方法:
對於絲狀真菌和壹些放線菌來說,可以在培養基上測出壹定時間內菌絲生長的長度,或者用壹端開口、帶有刻度的細玻璃管就可以得到。
培養基,放置,在開口的壹端接種微生物,並在壹段時間後記錄菌絲體生長長度,以測量絲狀微生物的生長。
二、微生物計數法
2.1血細胞計數平板法:
血細胞計數板是壹種具有特殊結構尺度和厚度的厚玻璃板。載玻片上有四個凹槽和兩個脊,中央有壹個短的水平凹槽和兩個平臺。兩個脊的表面比兩個平臺高0.1mm。每個平臺上刻有不同規格的格子,中心0.1mm2的面積上刻有400個小方塊。用油鏡觀察,統計某個大細胞中的微生物數量,就可以計算出1 ml菌液中所含的細菌數量。這種方法簡單、直觀、快速,但只適用於對單細胞微生物或絲狀微生物產生的孢子進行計數,結果是包括死細胞在內的細菌總數。
2.2染色計數法:
為了彌補某些微生物在油鏡下不易觀察計數,血細胞計數平板法無法直接區分死細胞和活細胞的不足,人們發明了染色計數法。借助不同的染料,在顯微鏡下可以更方便地計數活菌。例如,可以用亞甲藍染色液來計數酵母活細胞的數量。染色後,活細胞無色,死細胞藍色。
2.3比例計數法:
將已知顆粒濃度(如黴菌孢子或紅細胞)的液體與待測細胞濃度的細菌溶液按壹定比例均勻混合,在顯微鏡視野內計數各自的數量,即可得到未知細菌溶液的“細胞濃度”。這種計數方法比較廣泛。並且有必要制備具有已知顆粒濃度的懸浮液作為標準。
2.4液體稀釋法:
未知細菌樣本被連續稀釋10倍。根據估算,從最合適的10倍連續三次稀釋中取5 ml樣本,然後接種到含***15培養基的三組試管中。培養後,記錄每個稀釋度下生長的試管數,然後檢查最大概率表MPN(mostparylnumber)。這種方法常用於檢測食品中的微生物,如飲用水和牛奶的微生物限度檢查。
2.5平板菌落計數法:
這是最常用的活菌計數方法之壹。將待測菌液進行梯度稀釋,取壹定體積稀釋後的菌液在固化前與合適的固體培養基混合均勻,或將菌液塗布在固化後的固體培養基平板上。孵育後,原始細菌溶液的細菌計數可以通過將平板上出現的菌落數乘以細菌溶液的稀釋度來計算。壹般直徑9cm的平板上出現50-500個菌落。但方法比較麻煩,操作者需要熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得到菌液中的活菌數,而且可以壹次分離培養菌液中的細菌,得到單克隆。
2.6試紙法:
在平板計數法的基礎上,開發了用於快速計數的小型商用產品。有小而厚的濾紙片,瓊脂片等。在濾紙和瓊脂上吸取合適的培養基,加入活性指示劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,無色)浸泡試驗菌液,然後在密封包裝袋中培養。短期培養後,濾紙上出現具有壹定密度的玫瑰色小菌落,對照標準紙色板上的光譜,即可估算出樣品的細菌含量。試紙計數法快速準確,避免了平板計數法的人為操作誤差。
2.7薄膜過濾法:
用特制濾膜過濾壹定體積的含菌樣品,用橙色染色,在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光。活細胞會發出橙色熒光,而死細胞會發出綠色熒光。
2.8生理指數法:
微生物的生長伴隨著壹系列生理指標的變化,如發酵液的pH、含氮量、含糖量、產氣量等。與生長量平行的生理指標有很多,可以作為生長測量的相對值。
2.9氮含量的測定:
大多數細菌的含氮量為12.5%幹重,酵母為7.5%,黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25,可以確定粗蛋白的含量。測定氮含量的方法有很多,如硫酸消化法、高氯酸消化法、碘酸消化法、磷酸消化法和杜馬斯法測定N2氣體。杜馬斯測量N2氣體的方法是將樣品與CuO混合,在CO2氣流中加熱,產生氮氣,收集在呼吸計中,用KOH吸收CO2後測量N2的量。
2.10碳含量的測定:
將少量生物材料(0.2-2.0毫克幹重)混合到1毫升水或無機緩沖液中,用2毫升2% K2Cr2O7溶液在1000℃加熱30分鐘,然後冷卻。加水稀釋至5 ml,在580nm波長處讀取吸光度值,計算生長量。需要使用試劑作為空白對照,使用標準樣品作為標準曲線。
2.11還原糖測定方法:
還原糖通常指單糖或寡糖,可被微生物直接利用。還原糖的測定可以間接反映微生物的生長情況,常用於大規模工業發酵生產中微生物生長的常規監測。方法是:將發酵液離心,取上清液,加入費林試劑,沸水浴煮沸3分鐘,取出加少許鹽酸酸化,在接近終點時加入澱粉溶液,繼續加入Na2S2O3至終點,查表讀出還原糖含量。
2.12氨基氮的測定:
方法是將發酵液離心,取上清液,加入甲基紅和鹽酸作為指示劑,加入0.02N NaOH調節顏色至顏色剛好褪色,加入18%中性甲醛作為底物,反應幾分鐘,加入0.02N變色,根據NaOH的量計算氨基氮的含量。根據培養基中氨基氮的含量,可以間接反映微生物的生長狀況。
2.13其他生理物質的測定:
P、DNA、RNA、ATP、NAM(乙酰胞壁酸)的含量和其他指標,如產酸、產氣、產CO2(以標記葡萄糖為底物)、耗氧量、粘度和產熱,都可以用來確定生長。還可以根據反應前後底物濃度的變化、最終產氣量和微生物活性來反映微生物的生長情況。比如BMP-2的發酵生產,我總是通過監測溶解氧和pH值的變化來判斷細菌的生長情況。
擴展:微生物的現代定義
肉眼很難看清楚,需要借助光學顯微鏡或電子顯微鏡觀察。微生物包括細菌、病毒、真菌和壹些藻類。(但有些微生物是肉眼可見的,比如蘑菇和靈芝,屬於真菌。)病毒是壹種由核酸和蛋白質組成的“無細胞生物”,但其生存必須依賴活細胞。根據環境的不同,可分為空間微生物、海洋微生物等。,並按細胞結構可分為原核微生物和真核微生物。
微生物的主要特征
身材小臉大
體積不變的物體,切得越小,相對表面積越大。微生物很小,比如壹個典型的球菌,體積約1mm,但表面積很大。這壹特性也是賦予微生物代謝快等其他特性的基礎。
吸得多轉得快。
微生物通常具有極其高效的生化轉化能力。據研究,乳酸菌可在1小時內分解自身重量1000-10000倍的乳糖,產朊假絲酵母的蛋白質合成能力是大豆蛋白的100倍。
快速生長和繁殖
與大型動物相比,微生物具有非常高的生長和繁殖速度。大腸桿菌在12.5-20分鐘內可繁殖1次。我們來計算壹下,1大腸桿菌20分鐘除以1次,1小時除以3次,1晝夜除以24次= 72次,大約可以產生4722366500萬億(2的72次方),這是壹個非常龐大的數字。但實際上,由於各種條件的限制,如營養缺乏、競爭加劇、生存環境惡化等原因,微生物並不能完全實現這種指數級的增長。已知大多數微生物生長的最適pH範圍在7.0左右(6.6~7.5),部分在4.0以下。
微生物的這壹特性使其在工業上得到廣泛應用,如發酵、單細胞蛋白等。微生物是人類不可或缺的好朋友。
適應性和可變性強
分布廣泛且多樣。
微生物對我們生活的影響
微生物對人類最重要的影響之壹就是傳染病的流行。人類50%的疾病是由病毒引起的。微生物引發人類疾病的歷史,也是人類與之鬥爭的歷史。在疾病的預防和治療方面,人類已經取得了很大的進步,但新的和再現的微生物感染不斷發生,如大量的病毒性疾病壹直缺乏有效的治療藥物。有些疾病的發病機制還不清楚。大量廣譜抗生素的濫用造成了強大的選擇壓力,使許多菌株發生變異,產生耐藥性,對人類健康造成新的威脅。有些節段病毒可以通過重組或重排發生變異,最典型的例子就是流感病毒。每次疫情流感發生時,流感病毒都會從上次導致感染的毒株變異而來。這種快速突變給疫苗的設計和治療造成了很大的障礙。耐藥結核桿菌的出現,使得原本幾乎得到控制的結核病感染在全球範圍內肆虐。
微生物有很多種,其中壹些是腐敗的,即引起食物氣味和組織結構的不良變化。當然,有些微生物是有益的。它們可以用來生產奶酪、面包、泡菜、啤酒和葡萄酒。微生物非常小,必須用顯微鏡放大才能看到。比如中等大小的細菌,1000就只有壹個句號那麽大。
微生物會致病,會引起食物、布匹、皮革等發黴腐爛,但微生物也有有益的壹面。正是弗萊明首次從抑制其他細菌生長的青黴菌中發現青黴素,這是醫學領域劃時代的發現。後來從放線菌的代謝產物中篩選出大量抗生素。抗生素的使用在第二次世界大戰中拯救了無數的生命。壹些微生物被廣泛用於工業發酵生產乙醇、食品和各種酶制劑。壹些微生物可以降解塑料,處理廢水和廢氣等。,並具有巨大的可再生資源潛力,被稱為環境微生物;還有壹些微生物可以在高溫、低溫、高鹽、高堿、高輻射等極端環境下生存,還有壹些微生物依然存在。看似發現了很多微生物,但實際上由於培養方法等技術手段的限制,人類今天發現的微生物只占自然界現存微生物的壹小部分。
微生物之間的相互作用機制也相當神秘。比如健康人的腸道內存在大量的細菌,稱為正常菌群,包括上百種細菌。在腸道環境中,這些細菌相互依存,互惠互利。食物、有毒物質甚至藥物的分解和吸收,菌群在這些過程中的作用,以及細菌之間的相互作用機制,都還是未知的。壹旦菌群失衡,就會引起腹瀉。
隨著醫學研究進入分子水平,人們對基因、遺傳物質等專業術語越來越熟悉。公認遺傳信息決定了生物體的生命特征,包括外部形態和生命活動,而生物體的基因組就是這些遺傳信息的載體。因此,弄清生物體基因組所攜帶的遺傳信息,將對揭示生命的起源和奧秘有很大幫助。
工業微生物涉及食品、制藥、冶金、采礦、石油、皮革、輕化工等多個行業。通過微生物發酵生產抗生素、丁醇、維生素C和制備壹些風味食品;壹些特殊的微生物酶參與皮革脫毛、冶金、采油和采礦,甚至直接用作洗衣粉的添加劑。此外,壹些微生物代謝產物可作為天然微生物農藥廣泛應用於農業生產。通過對枯草芽孢桿菌基因組的研究,發現了壹系列與生產抗生素和重要工業用酶相關的基因。乳酸菌作為壹種重要的微生態調節劑,參與食品發酵過程。對乳酸菌進行基因組學研究將有助於找到關鍵的功能基因,進而改造該菌株,使其更適合工業化生產過程。我國維生素C兩步發酵工藝中的關鍵菌株氧化葡萄糖酸桿菌的基因組研究,將在基因組測序的前提下,發現與維生素C生產相關的重要代謝功能基因,通過基因工程改造實現新工程菌株的構建,簡化生產步驟,降低生產成本,進而大幅提高經濟效益。工業微生物的基因組研究不斷發現與重要代謝過程和代謝產物相關的新的特殊酶基因和功能基因,並將其應用於生產和傳統產業和工藝的改造,推動了現代生物技術的快速發展。
經濟作物柑橘的病原是世界上第壹個公布全序列的植物病原微生物。還有壹些在分類學、生理學和經濟價值上非常重要的農業微生物,如我國正在研究的胡蘿蔔軟腐歐文氏菌、植物病原假單胞菌和黃單胞菌。最近,植物中固氮根瘤菌的完整序列剛剛被確定。借鑒從人類病原微生物的基因組信息中篩選治療藥物的成熟方案,可以嘗試性地應用於植物病原。尤其是柑橘的病原菌,需要昆蟲媒介來完成其生活史,只有通過基因研究找到毒力相關因子和抗性靶標,才能制定出更有效的防治策略。固氮菌所有遺傳信息的分析,對於開發利用其關鍵固氮基因,提高作物產量和品質也具有重要意義。[10]
能在極端環境下生長的微生物稱為嗜極微生物,也稱為嗜極微生物。極端微生物對極端環境有很強的適應性。極端微生物基因組的研究有助於在分子水平上研究微生物在極端條件下的適應性,加深對生命本質的認識。